贮藏温度与时间对榉树种子活力及抗氧化特性的影响

李铁华 ，张 伟 ，文仕知 ，申 展 ，朱晋春 ，姚振一

(1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005)

贮藏温度与时间对榉树种子活力及抗氧化特性的影响

李铁华1，张 伟1，文仕知1，申 展1，朱晋春2，姚振一1

(1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005)

为了更好的探讨榉树种子贮藏技术，分别用不同的贮藏温度(3℃、10 ℃、常温)和贮藏时间的榉树种子作研究对象，分别检测了榉树种子的田间出苗率、超氧阴离子(O2-·)生成量、过氧化氢(H2O2)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性及过氧化物酶(POD)活性，结果表明：冰箱中3℃贮藏的榉树种子具有最高的田间出苗率，超氧阴离子(O2-·)生成量、过氧化氢( H2O2)含量最低，且超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性及过氧化物酶(POD)活性高，能及时迅速清除超氧阴离子(O2-·)、过氧化氢 (H2O2)及其它自由基，避免了它们对种子的伤害，种子的活力得以保持在较高水平，具有较高的田间出苗率，因此冰箱中3℃是榉树种子比较好的贮藏温度。

榉树种子；活力；抗氧化特性；贮藏温度；自由基

榉树Zelova schneideriana，属榆科落叶乔木，分布于黄河流域以南的华中、华南及西南各省区；一般在海拔800 m以下。榉树是国家Ⅱ级保护植物，现存资源非常稀少，急需加强资源保护和加快繁殖。榉树材质坚硬，心材紫红色，花纹美观，是珍贵的硬阔叶用材树种；另外，榉树树形优美，叶色随季节发生变化，近年来被许多地区开发为风景园林树种[1]。

种子活力是一个考察种子品质和未来苗木生长潜能综合状况的指标。在贮藏过程中，许多植物的种子，其活力都表现出不同程度的下降，植物不同，种子的生理生化特性和生态学特性各异，因而种子的耐贮藏特性和活力变化情况表现出较大的差异，贮藏条件不同也将影响种子活力的变化。覃柳燕等发现，山豆根种子的活力随着贮藏时间的延长逐渐下降，4 ℃更适合贮藏，可贮藏6个月，室温贮藏在1个月之内[2]；易官美等研究认为，在室内盒藏、冰箱冷藏和茶园堆藏的条件下, 茶园堆藏具有较好的效果，茶树的种子活力能够较好地保持[3]。就林木种子来说，目前，只研究了少数几个树种种子的活力，研究的主要方面是关于林木种子活力的高低与种子质量的关系[4-5]，极少见珍稀树种种子活力的研究报道，而对珍稀树种种子活力变化及抗氧化特性及其相关影响因素的研究则更少。榉树母树与种源稀缺，且结实有大小年现象，为了改进榉树种子的贮藏方法，更好地开发和利用这一珍贵的遗传资源，研究其种子活力及抗氧化特性变化与贮藏条件的关系，具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 榉树种子

2009年10月在湖南省古丈县采集了供试验用的榉树种子。新鲜榉树种子采回后，薄层放置在通风荫凉的地方，让其自然干燥至含水量13%以下。然后取一部分种子进行发芽试验，另一部分种子进行贮藏，贮藏时间分别为0、2、4、6、12和18个月。试验所用种子的千粒重为16.7 g。

田间试验过程中受环境及其它因素的影响比较大，采用8次重复试验，其它所有试验皆为重复3次。

1.2 种子贮藏

将自然干燥后的榉树种子分别以不同的方式进行贮藏：(1)实验室常温贮藏；(2)冰箱中10 ℃贮藏；(3)冰箱中3℃贮藏。

1.3 田间试验

分别以不同贮藏温度和不同贮藏时间的榉树种子，在盆栽土壤中进行点播，以盆栽土壤中的出苗率作为田间出苗率。

1.4 超氧阴离子(·)生成量

利用罗广华[6]和Chaitanya[7]的方法进行测定。

1.5 过氧化氢(H2O2)含量

利用Brenan[8]和阮英[9]的方法进行测定。

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性

使用邹琦[10]的方法进行测定。

1.7 过氧化氢酶(CAT)活性

使用邹琦[10]和Candan[11]的方法-紫外吸收法进行测定。

1.8 过氧化物酶(POD)活性的测定

使用 Nakano[12]和赵亚华[13]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 贮藏温度和时间对田间出苗率的影响

表1表明，贮藏2个月，3种贮藏温度对榉树种子田间出苗率均没有明显的影响；超过2个月，3种贮藏温度贮藏的榉树种子，随着贮藏时间的延长，田间出苗率都逐渐下降，但下降的快慢程度不同；常温贮藏的榉树种子，贮藏2个月后，田间出苗率就开始快速下降，而在冰箱10 ℃和冰箱3℃贮藏时，分别在榉树种子被贮藏4个月和6个月后，田间出苗率开始快速下降，比常温贮藏的分别推迟2个月和4个月。同时，从表1还可以看出，不同的贮藏温度贮藏的榉树种子，其田间出苗率随贮藏时间的下降速度是不相同的，常温贮藏的下降最快，冰箱10 ℃贮藏的次之，冰箱3℃贮藏的下降最慢，到贮藏的第18个月，榉树种子的田间出苗率分别下降了75.9%、63.2%和35.9%。

表1 贮藏温度和时间与榉树种子田间出苗率Table 1Effects of storage temperatures and time on germination rate of Zelova schneideriana seeds in field

2.2 贮藏温度和时间对超氧阴离子(·)生成量的影响

图1贮藏温度和时间与种子超氧阴离子生成量的关系Fig.1Relationship between storage temperature and times and the content of · in seeds of Zelova schneideriana

2.3 贮藏温度和时间对过氧化氢(H2O2)含量的影响

图2 显示，随着贮藏时间的延长，榉树种子过氧化氢(H2O2)含量逐渐增加，2个月后，过氧化氢(H2O2)含量上升速度加快，其中常温贮藏的增加最快，冰箱10 ℃贮藏次之，冰箱3℃贮藏增加最慢。贮藏6个月后，不同温度贮藏的榉树种子的过氧化氢(H2O2)含量存在显著差异(P＜0.05)，贮藏18个月后，常温贮藏的榉树种子的H2O2含量达到47.6 μmol/g，而冰箱3℃贮藏的榉树种子的H2O2含量为22.5 μmol/g，前者为后者的2.1倍。

图2种子中过氧化氢(H2O2)含量随贮藏时间的变化关系Fig.2Changing relationship between storage times andthe content of H2O2 in Zelova schneideriana seeds

2.4 贮藏温度和时间对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

图3 显示的是使用不同的贮藏温度，榉树种子超氧化物歧化酶(SOD)活性随着贮藏时间延长的变化情况，在最初2个月的贮藏中，榉树种子的SOD活性变化不大，仅略有升高，2个月后开始大幅上升，常温贮藏和冰箱10 ℃贮藏的榉树种子的SOD活性都在贮藏的第4个月达到最高，分别为68.4和77.9 U/mg protein；冰箱3℃贮藏的榉树种子的SOD活性在贮藏的第6个月达到最高，103.7 U/mg protein，冰箱3℃贮藏的榉树种子的SOD活性最高，高活力持续的时间最长。随后所有种子的SOD活性都开始下降。

图3 贮藏温度和时间与种子超氧化物歧化酶(SOD)活性的关系Fig.3Relationship between storage temperature and times and the activity of SOD in Zelova schneideriana

2.5 贮藏温度和时间对过氧化氢酶(CAT)活性的影响

从图4可以看出，3种贮藏温度贮藏的榉树种子的过氧化氢酶活性都随着贮藏时间的延长而逐渐增加，常温和冰箱10 ℃在贮藏的第4个月、冰箱3℃在贮藏的第6个月，其过氧化氢酶活性分别达到最高，随后开始下降；从0～4个月，冰箱3℃和10 ℃贮藏的榉树种子的过氧化氢酶活性几乎相同，4～6个月后，冰箱3℃贮藏的榉树种子的过氧化氢酶活性继续上升且在第6个月最高，达到16.5 U/mg protein。

图4 贮藏温度和时间与种子过氧化氢酶(CAT)活性的关系Fig. 4 Relationship between storage temperatures and time and the activity of CAT in Zelova schneideriana seeds

2.6 贮藏温度和时间对过氧化物酶(POD)活性的影响

图5 显示，在0～4个月，随着贮藏时间的延长，榉树种子的过氧化物酶(POD)活性逐渐升高，在贮藏的第4个月，过氧化物酶的活性达到最高，这时，冰箱3℃贮藏的榉树种子的过氧化物酶活性为15.62U/mg protein、冰箱10 ℃贮藏的为12.42U/mg protein、常温贮藏的为10.37 U/mg protein，随后都开始下降。从贮藏的第2个月起，冰箱3℃贮藏的榉树种子的过氧化物酶活性一直最高，冰箱10 ℃贮藏的次之，常温贮藏的最低。

图5 贮藏温度和时间与种子过氧化物酶(POD)活性的关系Fig. 5 Relationship between storage temperature and times and the activity of POD in Zelova schneideriana

3 讨 论

种子的田间出苗率反映的是种子的抗逆能力，是种子活力水平的具体表现。一般认为，种子发芽势大的，其活力较高，田间出苗率也高，李培旺等研究了光皮树等3个油料树种，认为种子发芽势与种子的活力指数相关密切，发芽势高的，其活力指数也高[14]。表1显示，常温贮藏的榉树种子的田间出苗率下降快，表明活力水平下降快；冰箱3℃贮藏的榉树种子的田间出苗率下降慢，活力水平高；而冰箱10 ℃贮藏的榉树种子的活力水平介于两者之间。

生物体内出现的自由基大多是·OH及其活性衍生物与超氧阴离子·，在生物体处于正常的情况下，自由基的产生与淬灭处于动态平衡状态，使自由基处于较低的水平，这种平衡一旦被打破和破坏，自由基就会逐渐积累，当积累的量达到一定程度，就会对细胞和组织产生伤害，从而加快生物体衰老的速度和进程[15]。李颜与王倩研究了人工老化后的大葱种子，老化后低活力种子的自由基含量迅速增加，老化1天自由基含量增加了70%，而老化6天增加高达191%[16]。本研究中（见图1），到贮藏的第18个月，常温贮藏的榉树种子的超氧阴离子(生成量远高于冰箱 3℃贮藏的，前者是后者的2.9倍，导致了常温贮藏的榉树种子受到伤害而迅速衰老，活力下降。

植物在衰老过程中，由于体内活性氧代谢平衡被破坏而使H2O2发生累积。H2O2是一种强氧化剂，可以使细胞内的核酸、蛋白质等生物大分子直接或间接地被氧化，也能使细胞膜及细胞器的膜系统遭受损害，从而导致和加速了组织与细胞的衰老、解体。本研究中，从榉树种子中H2O2的含量来看（见图2），贮藏18个月后，常温贮藏的榉树种子的 H2O2含量 (47.6 μmol·g-1)是冰箱3℃贮藏的 (22.5 μmol·g-1)2.1倍。冰箱 3℃贮藏的比常温贮藏的低得多，种子本身受到H2O2的伤害相对较轻，种子活力高。

许多研究认为，SOD是应对氧自由基伤害的第一道防线，也是植物抗氧化作用的关键酶类。SOD的主要作用是在生物体内催化·形成H2O2。SOD的活性变化应从两个方面来分析，一方面，生物体本身的衰老与外界的生理胁迫常导致体内大量产生·，·是SOD作用的底物，·的大量产生和积累会刺激和诱导SOD的合成并且会提高其活性，SOD活性的提高，能及时和高效地清除，使植物抗衰老和忍受不良环境的能力得到提高[17]；另一方面，当生物体衰老达到一定的程度，其SOD等酶的活性也开始下降[18]，而SOD等酶的活性下降，标志着生物体衰老已进行到一定的程度。在抗氧化系统中，SOD是与CAT协同作用的，SOD催化清除·所形成的产物H2O2正是CAT催化作用的底物[19]。综合分析本研究的图3和图4可以看出，在贮藏的初始阶段，SOD和CAT的活性都开始上升，且SOD与CAT的活性强度在变化趋势上具有一定的一致性，表明了在贮藏的榉树种子中，SOD与CAT具有协同作用。在本研究中，常温贮藏和冰箱10 ℃贮藏榉树种子在贮藏的第4个月开始，SOD与CAT的活性都快速下降，因而催化·和 H2O2分解的能力下降，导致了这两种物质的大量增加和积累，造成了对种子的伤害，导致了种子活力下降；而冰箱3℃贮藏榉树种子的SOD与CAT的活性相对较高，且高活力持续的时间长，延缓了和 H2O2的增加和积累，减轻了它们的伤害，种子活力高。

POD活性大小，影响乙烯和木质素的合成，与植物清除氧自由基的能力有关，也与植物生长和衰老过程有关[20-21]。植物体内POD活性低，清除氧自由基的能力弱，反之，则清除氧自由基的能力相对较强。梁海荣等报道，随着小麦种子活力的下降,它的过氧化物酶( POD) 、过氧化氢酶（CAT） 等酶类的活性也随之下降[22]；朱世杨等人研究发现，老化的花椰菜种子经GA3处理后活力得到提高，其过氧化物酶( POD)活性也得到相应的提高[23]。本研究表明(图5)，3种不同贮藏温度下，冰箱3℃贮藏的榉树种子的POD活性高，清除氧自由基的能力强，迅速而及时地清除了氧自由基，种子少受氧自由基的伤害，种子活力下降慢，活力相对较高。

4 结 论

(1)随着贮藏时间的延长，榉树种子的田间出苗率逐渐下降，常温贮藏的下降最快、冰箱10℃贮藏的次之、冰箱3℃贮藏的下降最慢，说明冰箱3℃贮藏的榉树种子的活力得到较好的保存，种子活力高。

(2)随着贮藏时间的延长，常温贮藏的榉树种子的超氧阴离子(·)生成量和过氧化氢 (H2O2)含量都较高，给种子本身造成了伤害，使种子活力下降，种子活力低；而冰箱3℃贮藏的榉树种子的超氧阴离子(·)生成量和过氧化氢(H2O2)含量都较低，给种子本身造成的伤害轻，种子活力下降慢，种子活力高。

(3)冰箱3℃贮藏的榉树种子的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性及过氧化物酶(POD)活性都较高且高活性持续的时间长，及时迅速清除了超氧阴离子(O2-·)、过氧化氢(H2O2)及其它自由基，避免了它们对种子的伤害，种子的活力得以保持，种子的活力高。

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Effects of storage temperature and time on antioxidant properties and vigor change of Zelkova schneideriana seed

LI Tie-hua1, ZHANG Wei1, WEN Shi-zhi1, SHEN Zhan1, ZHU Jin-chun2, YAO Zhen-yi1
(1.Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Polytechnic of Environment and Biology, Hengyang 421005, Hunan, China)

In order to fi nd better method for preserving seeds ofZelova schneideriana, the seeds ofZelova schneiderianapresenved with different temperatures and different time, were used as test material. The germination rate in fi eld, the content of· and H2O2and the time activites of SOD and CAT and POD of the seeds ofZelova schneiderianawere evaluated. The results indicated that the seeds ofZelova schneiderianawhich were stored in refrigerator at 3℃ had the highest fi eld seedling emergence rates, the activites of SOD and CAT and POD, and had the lowest contents of· and H2O2; on other hand, the· and H2O2and other free radical can be eliminated quickly because of high activites of SOD and CAT and POD. So the injury to these seeds was decreased, and the vigor of the seeds ofZelova schneiderianawas kept on a high level.

Zelova schneiderianaseed; vigor; antioxidant properties; storage temperature, free radical

S718.43

A

1673-923X(2012)09-0001-05

2012-06-21

国家林业公益性行业专项基金项目（201004066）；中南林业科技大学人才引进资助项目(07Y013)

李铁华（1964-），男，湖南衡东人，教授，博士，主要从事林木种苗生理生态及森林培育方面的研究；

E-mail：tiehuali2000@yahoo.com.cn

[本文编校:吴 毅]