人Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子抗肿瘤作用研究进展

冯 洁，伦永志*

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622;

2. 大连大学 医学院 辽宁省高校生物物理学重点实验室, 辽宁 大连 116622）

人Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子抗肿瘤作用研究进展

冯 洁1，伦永志2*

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622;

2. 大连大学 医学院 辽宁省高校生物物理学重点实验室, 辽宁 大连 116622）

围绕人Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的结构、主要成员及其抗肿瘤作用做一综述。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子在机体内发挥重要的生理作用，具有广泛的研究和应用价值。它们在各种肿瘤中有着或高或低的表达，与肿瘤发生、发展相关，可能成为肿瘤治疗的新标靶。

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子；结构；抗肿瘤作用

癌症病变过程中最重要的步骤是肿瘤细胞的浸润和转移，其关键取决于肿瘤细胞的某种分泌物能够水解细胞外基质（Extra Cellular Matrix，ECM）和基底膜（Basement Membranem，BM）。肿瘤细胞先分泌尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type Plasminogen Activator，uPA），此激活物为一种丝氨酸蛋白酶，可激活纤溶酶原产生纤溶酶（Plasmin，PLM）；PLM继而降解ECM，同时还能激活前基质金属蛋白酶成为基质金属蛋白酶，后者参与细胞外基质蛋白的水解作用；最终ECM与BM被水解，肿瘤细胞得以扩散。因此，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以从源头抑制肿瘤转移。

丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serine Proteinase Inhibitors, Serpin）广泛存在于各生物体内。Serpin在生物体内有着很重要的作用，如保护神经作用；对抗有害生物破坏；吸血昆虫体内的抗凝血作用[1]等。已在细菌、病毒、真核生物中发现并鉴定了500多种类型Serpin。Serpin是单肽链的球蛋白，各种Serpin有30%左右的同源序列，疏水区同源性约70%。常见的类型包括Kazal型、Kunitz型、α-巨球蛋白、Bowman-Brik、pacifastin家族等。Kazal型Serpin较为保守，是由Kazal发现并命名的一种胰蛋白酶抑制因子，主要存在于哺乳动物中，目前已发现100多种，多为小分子多肽，大多能够抑制肿瘤细胞的增殖和活性[1]。越来越多的研究显示Kazal型Serpin家族某些成员参与调节肿瘤细胞的侵袭与转移，影响肿瘤细胞因子和信号转导途径中细胞因子的表达，从而成为肿瘤治疗的新标靶。尽管Kazal型Serpin较为保守，但由于其承受残酷的进化压力，其活性部位高度易变，导致功能的多样性且有些抑制剂已丧失原有功能，给研究带来极大挑战[2]。

1 结构特征

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子由一个或多个保守的Kazal结构域组成，其间由肽段相连。典型的Kazal结构域如图1。

图1 Kazal结构域保守序列

如图1所示，Kazal结构域中的某些氨基酸非常保守，但大部分仍高度可变的。结构域中含有6个半胱氨酸，第1、5；2、4；3、6之间形成三对二硫键。三对二硫键对维持抑制因子的抑制活性至关重要，高温和二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）作用可使二硫键失去抑制活性[1]。无脊椎动物中Kazal结构域缺乏特定的二硫键而被称为非典型Kazal结构域。Kazal结构域的二级结构由一个螺旋和三个反向平行的折叠组成，其结构可以看做由A、B、C三个环构成，其中B环含有决定抑制特异性的P1位点（如图1所示）。P1位点位于第二个半胱氨酸后第二位。P1位点的不同氨基酸决定了Kazal型Serpin抑制不同的蛋白酶[3]。

2 主要成员

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serine Protease Inhibitor kazal type, SPINK）家族与胰腺炎或胰腺癌、肝癌、食管癌等疾病关系密切。目前已发现SPINK1、SPINK2、SPINK4、SPINK5、SPINK6、SPINK7等多个亚族。表1为SPINK家族基因及蛋白特征的介绍，表2是人SPINK家族蛋白在哺乳动物中的分布情况及功能的介绍[4]。

表1 SPINK家族基因及蛋白特征

表2 人SPINK家族蛋白在哺乳动物中的分布及功能

2.1 SPINK1

SPINK1又称PST1，分子量为7.5 kb，是Horii A于1987年分析大量遗传性胰腺炎患者时发现的，将其命名为SPINK1。

Bimaljit Sandhu等研究报道胰腺炎/胰腺癌患者中N34S突变频率较高[5]，但并非所有此位点突变的人都患有慢性胰腺炎或胰腺癌，推断N34S在慢性胰腺炎/胰腺癌病发中可能起重要作用，却不是最关键的一个位点，即其可能与其它位点突变共同作用引发疾病。张敏等[6]证实了囊性纤维跨膜转运调节因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductancere Gulator，CFTR）及SPINK1与慢性胰腺炎及胰腺癌相关。正常胰腺中CFTR、SPINK1蛋白阳性表达，阳性率都为100%。部分慢性胰腺炎细胞或组织中可见CFTR、SPINK1表达，阳性表达率分别为50%、55%。胰腺导管癌细胞中偶见CFTR、SPINK1表达，阳性表达率分别为10%、6.7%。结果显示CFTR、SPINK1蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中表达丢失，这种异常可能与二者发生发展有着一定关系。由于CGTR功能不全，离子分泌障碍，导致分泌液PH值下降。酸性条件下引起组织炎症损害的同时，可导致胰酶分泌及激活的异常，使胰腺的纤维化及功能不全。SPINK1蛋白则可能作为一种修饰因子，降低胰腺癌发病的阈值或与其它基因共同促进胰腺癌发生，也可能由于细胞癌变使SPINK1表达发生变化。

研究发现部分前列腺癌患者[7]和乳腺癌患者[8]肿瘤组织中SPINK1高度表达，正常组织中则不存在。利用免疫组织化学方法进行研究证明，SPINK1可影响乳腺癌肿瘤细胞的侵袭性：影响它们的增殖，扩散和对药物的抗性[8]。现已对其作用机制等进行研究，希望SPINK1可成为治疗前列腺癌、乳腺癌的标靶，或用于早期诊断。

2.2 SPINK6

SPINK6又称EG433180，是2009年复旦大学的黄青山教授研究细小病毒抗肿瘤作用时发现的，SPINK6能有效针对原发性肝癌中的癌细胞转移、复发机制，起到抑制肿瘤细胞的浸润和转移的作用。其作用原理尚处于实验观察、初步探索阶段，推测SPINK6可能通过影响抑癌基因p53来抑制肿瘤细胞恶性增生；或是通过调节细胞粘附力和运动能力抑制肿瘤细胞浸润、转移。

较新的研究发现，肝内淋巴细胞中二肽基肽酶I的表达会产生颗粒酶B和穿孔素，颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶，进入靶细胞可介导细胞凋亡。穿孔素可使颗粒酶进入靶细胞，引起靶细胞凋亡。SPINK6、SPINK9可抑制颗粒酶B和穿孔素。SPINK6、SPINK9在免疫细胞（如抗原呈递细胞、细胞毒性T淋巴细胞等）中表达，可抵制颗粒酶B的活性；在肿瘤细胞或病毒性感染的肝病中表达可使肿瘤细胞和病毒等被细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞杀死。目前的研究将主要集中在肝淋巴细胞中颗粒酶B的活性和SPINK6、SPINK9表达之间存在的关联[9]。

激肽释放酶（Kallikrein, KLK）相关的肽酶是一类丝氨酸蛋白酶，Shigemasa K等发现KLK11在卵巢癌中的过度表达可能导致肿瘤细胞的增殖、扩增、转移[10]。最近，Tomasz Kantyka等研究发现SPINK6可抑制KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK12、KLK13、KLK14，其中对KLK6活性影响较大，其次是KLK4，但对KLK1、KLK3、KLK8和KLK11无明显抑制作用[11]。

2.3 SPINK7

SPINK7也称ECRG2（Esophageal Carcinoma Related Gene 2, ECRG2），是1998年陆士新等利用mRNA差异显示技术，从食管癌肿瘤组织中筛选、克隆所得的基因。基因cDNA全长572 bp，开放阅读框长258 bp，分子量为9.2 kD[12]。

SPINK7在成人正常食管组织中表达较高，在食管癌组织及其周边组织中表达较低或不表达。李美宁等研究证明，转染SPINK7表达蛋白可抑制EC9706细胞恶性增殖能力，并能部分逆转其恶性表型（停泊－非依赖性），通过Western Blotting检测发现，细胞转染ECRG2基因后，p53、p21蛋白表达升高[13]。实验证明，DNA损伤后，信号传导至p53蛋白，激活p53，延长其半衰期，促进p53下游靶基因p21转录。p21蛋白可与多种Cyclin、Cdk复合物（如CyclinD1-Cdk4、CyclinE-Cdk2等）结合，而后可抑制CyclinE-Cdk2、CyclinA-Cdk2的H1激酶活性，使细胞周期阻滞于G1期，使DNA损伤得以恢复，减少突变发生。另外，p21可以结合到增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)的C端，形成p21-PCNA复合体，抑制细胞的过度增殖[14]。

在肿瘤细胞中共转染SPINK7 cDNA、金属硫蛋白（Metallothionein, MT），二者相互作用，调控相关的信号通路，抑制肿瘤细胞增殖，并诱发肿瘤细胞凋亡。另外，对SPINK7基因进行筛查发现，在其3’非编码区存在一短小重复序列，其多态性与食管癌的易感性有关[13]。以上的研究证实了SPINK7与食管癌的发生密切相关。

2.4 Maspin

Maspin（Mammary Serine Proteinase Inhibitor）又称SERPINB5，是1994年Zou等通过消减杂交技术，从人正常乳腺上皮细胞中分离出的一种新基因，此基因cDNA全长2584 bp，定位于人染色体18q21.3～q23区，约1 kb的启动子区域存在多个转录因子结合位点，包括Ets，AP1，HRE及p53一致性结合位点，p53与p53一致性结合位点结合后可活化Maspin启动子，促进转录，突变型p53则失去此作用[15,16]。

Maspin对肿瘤具有抑制作用，包括抑制肿瘤浸润、转移，诱导细胞凋亡的作用。Liu J等发现Maspin可增加细胞对凋亡刺激的敏感性。此外，Maspin还具有转录调节的作用，其在正常和癌变乳腺上皮细胞的差异表达是在转录水平进行调节的。乳腺癌肿瘤发展期Maspin表达缺失或部分缺失，Maspin启动区内Ets和AP1-DNA结合的位点转录缺失导致Maspin表达消失或下降；Maspin启动区异常胞嘧啶甲基化作用和染色质凝聚导致Maspin基因表达沉默[17]。故在多种肿瘤组织中（如乳腺、卵巢、头部和颈部、胃、结肠等）Maspin表达下调，然而在胰腺癌组织中，却检测到Maspin的高表达，正常组织则相反。Cao D等利用免疫组织化学和高吞吐率的组织微阵列法进行研究，在223例切除胰腺癌肿瘤的外科手术中，观察发现maspin蛋白质几乎都有表达，只有14例Maspin表达不明显。剩余209例中有39例的肿瘤是良性未扩散的，170例的肿瘤已经扩散，扩散的病例中maspin的表达高于未扩散的病例[18]。Lockett等认为，在胰腺癌与其它癌症中maspin表达不一致的这种矛盾与病变部位上皮细胞内微环境的不同有关。Maspin对上皮微环境极为敏感，表明其对上皮细胞微环境的稳态调节起作用[19]。此外，Lewis等的研究结果表明，当Maspin进入癌细胞的细胞核时，肿瘤细胞的扩散能力明显受限，而当Maspin不是在细胞核中时，这种能力得到逆转，癌细胞更容易扩散。

3 结语

Kazal型Serpin是人体内很重要抑制因子，近年来多项研究已证明多种Kazal型Serpin可作为肿瘤抑制基因负向调控肿瘤细胞的浸润、转移，诱导凋亡等过程。尽管目前发现的某些Kazal型Serpin作用机制尚不明确，但其仍可作为抑癌基因。肿瘤发展期各抑制因子表达的含量变化使其有望成为肿瘤诊断及评估预后的标志物。可以通过某些药物使抑制因子再表达或是降低含量，来影响肿瘤细胞的增殖、转移。另外，多种Kazal型Serpin存在于正常人体内，具有相对较高的生物安全性，且其多数分子量小，易于重组表达或人工合成，有利于对其进行深入研究。

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Progresses in Anti-tumor Effects of Human Kazal-type Serine Protease Inhibitor

FENG Jie1, LUN Yong-zhi2*

(1. College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China;
2. Medical College, Liaoning Provincial University Key Laboratory of Biophysics, Dalian University, Dalian 116622, China)

This paper reviews the structures, key members and anti-tumor effects of human Kazal-type serine protease inhibitors. Kazal-type serine protease inhibitors play an important role in physiology, and also have extensive value of research and applications. They have a higher or lower expression levels in different types of tumor, and relate with initiation and development. They may become a new target for oncotherapy.

Kazal-type serine protease inhibitor; structure; anti-tumor effect

Q51

A

1008-2395(2012)03-0048-05

2012-04-13

大连市科技计划项目（2010E13SF138）。

冯洁（1987-），女，硕士研究生。

伦永志（1973-），男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：感染性疾病的分子生物学。