万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌侵染活性的影响

孙芬变，王金胜

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

尖孢镰刀菌侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害，病菌及其产生的胶状物能够通过侵染植物的导管[1]，从而使植物缺水萎蔫；也可以通过与植物相互作用产生细胞壁降解酶类从而破坏植物。万寿菊杀菌素是由山西农业大学生命科学学院相关课题组研制合成的，是在经过对万寿菊根粗提物中抑菌活性成分分离与分析鉴定以后，人工模拟合成的一类精油类杀菌制剂[2]。该药剂对尖孢镰刀菌的杀灭效果良好[3-4]。但是，关于杀菌剂对尖孢镰刀菌侵染活性的作用机理目前报道尚少。

本试验应用生理生化的方法研究了万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌侵染活性的影响，初步探索万寿菊杀菌素防治尖孢镰刀菌侵染活性的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp niveum（E.F.Smith）Snyder Hansen），由山西农业大学农学院植物病理实验室提供；万寿菊杀菌素水乳剂，由山西农业大学生命科学学院相关课题组研制合成。

1.2 方法

1.2.1 PDA 液体培养基 称取去皮切块土豆200 g，加水1 000 mL 煮沸30 min，双层纱布过滤，补充水分至1 000 mL，分装在10 个100 mL 三角瓶中，每个三角瓶分别加入2 g 的葡萄糖，用牛皮纸封口，于121 ℃灭菌20 min，4 ℃保存备用。

1.2.2 菌液的制备 在5 个250 mL 的无菌三角瓶中分别加入100 mL PDA 液体培养基，加入2个直径为6 mm 的菌饼接种，于25 ℃，120 r/min培养60 h。

1.2.3 试验设计 试验设CK 和A，B，C，D 共5个处理，即每个三角瓶的菌液中分别按照终浓度0，0.1，0.2，0.3，0.4 μg/mL 加入相应量的万寿菊杀菌素水乳剂，每个处理3 次重复。

1.2.4 尖孢镰刀菌电导值的测定 每隔24 h 取培养液5 mL，3 000 r/min 离心15 min，弃上清液，称取0.5 g 菌丝体（沉淀），用去离子水反复冲洗3 次后，加去离子水10 mL，静置30 min，测定电导值[5-6]。用电导值的变化衡量细胞膜透性的变化。

1.2.5 尖孢镰刀菌纤维素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性的测定 每隔24 h 按照李合生[7]的方法进行尖孢镰刀菌纤维素酶活性和β-D- 葡萄糖苷酶活性的测定。

2 结果与分析

2.1 万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌细胞膜透性的影响

不同质量浓度万寿菊杀菌素水乳剂处理尖孢镰刀菌后，尖孢镰刀菌菌膜透性的变化如图1所示。尖孢镰刀菌菌膜电导值的变化直接反映了其细胞膜的通透程度。

从图1 可以看出，同一处理时间下，电导值大小为处理D＞C＞B＞A＞CK，即随着万寿菊杀菌素水乳剂质量浓度的逐渐增加，电导值也随之增大。说明万寿菊杀菌素水乳剂作用于尖孢镰刀菌细胞膜会增加细胞膜的通透性，引起电解质外渗，进而抑制尖孢镰刀菌的生长。

2.2 万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌侵染力的影响

2.2.1 万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌纤维素酶活性的影响 图2 为万寿菊杀菌素水乳剂处理后，尖孢镰刀菌纤维素酶活性的变化情况。

从图2 可以看出，随着对照组尖孢镰刀菌不断的增殖，其纤维素酶活性也呈现出缓慢增长，在72 h 后呈现出基本平稳的水平波动趋势；而万寿菊杀菌素水乳剂处理的A，B，C，D 的纤维素酶水平则呈现出起伏不定，但是总体水平明显低于对照，且随着万寿菊杀菌素水乳剂添加量的增加，纤维素酶活性降低得越明显。说明万寿菊杀菌素水乳剂可以降低纤维素酶活性。

2.2.2 万寿菊杀菌素水乳剂对尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性的影响 图3 为万寿菊杀菌素水乳剂处理对尖孢镰刀菌β-D- 葡萄糖苷酶活性的影响。

从图3 可以看出，随着对照组尖孢镰刀菌不断的增殖，其β-D- 葡萄糖苷酶活性呈现出缓慢增长的趋势。而万寿菊杀菌素水乳剂处理的A，B，C，D 的β-D- 葡萄糖苷酶活性随处理时间的增加呈下降趋势，与对照组相比，明显下降，且随着万寿菊杀菌素水乳剂添加量的增加，β-D- 葡萄糖苷酶活性降低得越明显。说明万寿菊杀菌素水乳剂可以降低β-D- 葡萄糖苷酶活性。

3 讨论

长期使用传统农药对环境造成污染，给推动农业发展带来很多的不利影响[8]。本试验表明，万寿菊杀菌素水乳剂作为一种生物农药，能够使尖孢镰刀菌膜的透性增加，即当病原菌细胞膜的透性被破坏，病原菌菌体生物质膜功能受损，进一步会引起病原菌细胞功能紊乱[9]，最终导致其活力降低，侵染活性也随之下降。

植物细胞壁是防止病原菌入侵的天然屏障，这种天然屏障需要有专门的酶类来降解[10]。当病原菌与植物相互作用时，在细胞壁组分的诱导下，产生一些与细胞壁降解有关的酶类，它们在侵染寄主致病的过程中起到至关重要的作用[11]。国内外研究发现，纤维素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性水平的高低与尖孢镰刀菌的侵染力强弱呈现一定程度的关联[10]，而且β-D- 葡萄糖苷酶活性越高，则分解细胞壁的速度会越快[12]。本研究表明，万寿菊杀菌素水乳剂可以降低纤维素酶和β-D- 葡萄糖苷酶活性，且随着万寿菊杀菌素水乳剂添加量的增加，这2 类酶活性的降低越明显。说明万寿菊杀菌素水乳剂可通过降低细胞壁降解酶类的活性而降低尖孢镰刀菌的侵染活性。

总之，万寿菊杀菌素水乳剂能够通过对尖孢镰刀菌膜透性的影响以及对植物与病原菌相互作用产生降解细胞壁酶类的影响，使尖孢镰刀菌侵染活性下降，从而起到抑菌和保护植物的作用。

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