信号转导转录激活因子3抑制剂WP1066对肝细胞肝癌生物学特性影响的研究

张巨波 郭坤 陈漪 葛宁灵 任正刚

（复旦大学附属中山医院肝肿瘤内科，上海 200032）

信号转导转录激活因子3抑制剂WP1066对肝细胞肝癌生物学特性影响的研究

张巨波 郭坤 陈漪 葛宁灵 任正刚

（复旦大学附属中山医院肝肿瘤内科，上海 200032）

目的:探讨信号转导转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的抑制剂 WP1066在体外对人肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）增殖、侵袭能力的影响以及在体内应用时对HCC的抑制效果。方法:采用蛋白印迹、Transwell等方法检测在不同恶性潜能的人HCC细胞株中STAT3总蛋白及磷酸化水平的差异，观察应用WP1066后人HCC细胞株MHCC－97 H的增殖以及侵袭能力的改变。皮下接种MHCC－97 H细胞株建立裸鼠的HCC模型后，观察WP1066对肿瘤生长的影响。结果:STAT3磷酸化水平在恶性潜能高的人HCC细胞株中显著高于恶性潜能低的HCC细胞株；WP1066能显著抑制MHCC－97H的增殖和侵袭。在裸鼠HCC模型中，WP1066能有效地抑制HCC生长。结论:WP1066能抑制STAT3磷酸化水平而有效抑制HCC增殖和侵袭。

肝癌； 抑制剂； 信号转导转录激活因子3； 增殖； 侵袭

原发性肝癌居世界恶性肿瘤死因第3位，居我国恶性肿瘤死因第2位。在我国，该病的主要类型是肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），占原发性肝癌的90%以上［1］。信号转导转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在细胞因子和生长因子信号通路中发挥重要作用［2］。STAT3激活可影响细胞的增殖、凋亡和转移等，可上调血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的表达，它也是反映肿瘤预后的标志［3］。STAT3作为一个潜在的治疗靶点受到了广泛的关注［4］。本研究旨在探讨STAT3抑制剂WP1066对人HCC生物学特性的影响及其在体内对HCC生长的抑制作用。

1 资料与方法

1.1 细胞株

人HCC细胞株Hep3B、Hep G2购自美国标准生物收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），人HCC细胞株 MHCC－97L和MHCC－97 H由复旦大学肝癌研究所建立并保存。

1.2 细胞培养

Hep3B用含10%热灭活胎牛血清的MEM培养基培养，Hep G2、MHCC－97L和 MH－CC－97H用含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基培养，细胞生长至80%密度时用0.125%胰蛋白酶消化并传代。MEM、DMEM培养液和特级胎牛血清均由Gibco公司生产。

1.3 蛋白印迹 按常规方法进行。

1.4 细胞增殖实验

将对数生长期MHCC－97H细胞以5×104个/m L密度接种于96孔板（100μL/孔），WP1066按0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L分别给药，以0.9%氯化钠液干预的设为对照组，每组设4个副孔。连续培养72 h后，每孔加入20μL甲基四氮唑盐（methyl tetrazolium salt，MTS），并于37℃、5%CO2培养箱内孵育90 min。用酶标仪（波长490 nm）测量吸光值。

1.5 细胞侵袭实验

在 WP1066干预48 h后的MHCC－97 H细胞中，取5×104个细胞，加入铺有基底膜基质胶（basement membrane matrix，Matrigel）的Transwell上室，使总体积为100μL，在下室加入600μL条件培养液后于37℃、5%CO2的条件下培养24 h。取出Transwell小室，甲醛固定，结晶紫染色。在200倍光学显微镜下随机选择5个视野，计数每个视野穿膜细胞数目，取其平均值。

1.6 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （enzyme－linked immu－nosorbent assay，ELISA）

人VEGF－ELISA试剂盒购自R＆D公司，按试剂说明书方法检测，测定结果用酶标仪（主波长450 nm，辅助波长630 nm）读取光密度值，绘制标准曲线，求得VEGF的相对含量。

1.7 构建皮下人 HCC模型

雄性BALB/C－nu/nu裸小鼠，4～6周龄，12只，体质量15～18 g，购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分公司。在恒温（24～27℃）、恒湿（45%～50%）、无特异病原菌环境下分笼饲养，将水和饲料灭菌处理后供裸小鼠自由摄入。用0.125%胰酶消化对数生长期MHCC－97H细胞，调整细胞浓度（3×107个/m L），取0.2 m L接种于裸小鼠右前肢腋部皮下，接种10 d后将其随机分为对照组（0.9%氯化钠液灌胃）和 WP1066治疗组［40 mg/（kg·d）灌胃］，灌5 d停2 d，连续给药6周。每周测量皮下肿瘤长短径，根据体积＝长径×短径2×π/6计算肿瘤体积。给药6周后采集外周血，分离肿瘤并称其质量。

2 结 果

2.1 不同转移潜能HCC细胞株中STAT 3总蛋白及其磷酸化水平的检测

采用蛋白印迹方法检测Hep3B、HepG2、MHCC－97L、MHCC－97H 中STAT 3的总蛋白和磷酸化水平，结果显示STAT3总蛋白在各细胞株中的表现无显著差异，而STAT3磷酸化水平在转移潜能高的 MHCC－97H细胞株中显著升高，提示STAT3的磷酸化水平与HCC细胞的恶性生物学表型相关，见图1。

图1 STAT3在HCC细胞株中的磷酸化水平

2.2 WP1066体外对 MHCC－97H增殖和侵袭能力的影响

用0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L的 WP1066干预 MHCC－97 H细胞株48 h后，检测STAT3的磷酸化水平，结果显示高浓度 WP1066能显著抑制STAT3磷酸化水平，见图2。采用2μmol/L和6μmol/L两个浓度的WP1066干预MHCC－97H，在不同时间点检测细胞的增殖情况，结果显示WP1066对HCC细胞增殖的抑制成剂量依赖性，较高剂量的WP1066能有效抑制HCC细胞增殖，见图3A。取WP1066干预48 h的 MHCC－97H，检测其侵袭能力的变化，结果显示 WP1066能显著抑制MHCC－97 H的侵袭能力，见图3B。

图2 WP1066对MHCC－97H细胞株中STAT3磷酸化水平的抑制作用成剂量依赖性

2.3 WP1066对裸鼠成瘤的抑制作用

注射MH－CC－97 H在裸鼠皮下成瘤后，用 WP1066［40 mg/（kg·d）］灌胃。每周测量肿瘤体积1次。6周后获取肿瘤并称质量；采集外周血检测VEGF浓度；提取肿瘤组织中总蛋白并检测缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF－1α）的表达。结果显示，WP1066治疗组的肿瘤体积［（1085.8±220.1）mm3］和质量［（1.50±0.33）g］均显著小于对 照 组 ［（1525.4±324.6）mm3和 （2.16±0.34）g，P＜0.05］，说明 WP1066可以有效地抑制HCC的生长。WP1066治疗组HIF－1α表达下调，且该组外周血 VEGF［（55.0±18.9）pg/m L］显著低于对照组［（93.8±18.7）pg/m L］（P＝0.012），见图4。

3 讨 论

STAT3是信号转导转录激活因子家族的重要成员之一，它在细胞内起着重要的信号传递作用，能被很多细胞因子和生长因子激活，继而发生二聚体化进入到细胞核，与下游靶基因启动子区域的特异位点结合后调节靶基因的表达，从而在细胞的增殖、凋亡、转移和血管生成以及免疫调节等方面发挥重要作用［3，5－7］。现 有 的 研 究［2－3］提 示，STAT3 是 一 个癌基因，它的异常活化对恶性肿瘤的增殖和转移起关键作用，并与多种肿瘤的发生、发展和预后有密切的关系。

本研究显示，在具有不同侵袭和转移潜能的HCC细胞株 Hep3B、Hep G2、MHCC－97 H 和 MHCC－97L中STAT3总蛋白水平无显著差异，但其在MHCC－97H细胞株中的磷酸化水平显著升高，提示STAT3磷酸化水平和HCC细胞的恶性表型有一定的相关性。体外应用STAT3抑制剂WP1066干预HCC细胞株，结果显示WP1066对HCC细胞株中STAT3磷酸化水平的抑制呈剂量依赖性，这与其他肿瘤研究中关于STAT3机制的报道一致［8－9］。2μmol/L的 WP1066可以部分抑制HCC细胞增殖，但和对照组比较差异无统计学意义；6μmol/L WP1066则可以显著地抑制HCC细胞的增殖和侵袭。

HCC患者常伴有肝硬化，使之难以耐受化疗。因此，迫切需要寻找新的针对HCC的靶向治疗药物，使其在充分发挥抗肿瘤作用的同时而不对机体产生不良影响。本研究证实，采用40 mg/（kg·d）的WP1066可以抑制HCC的生长，且对裸鼠体质量无显著影响。

综上所述，STAT3信号通路在HCC的增殖和侵袭过程中发挥着重要的作用，STAT3抑制剂WP1066有望成为一种新的分子靶向药物。STAT3是如何与其他信号通路的关键分子联合发挥作用的则还有待于进一步研究。

［1］Chen M，Therneau T，Orsini LS，et al.Design and rationale of the HCC BRIDGE study in China:a longitudinal，multicenter cohort trial in hepatocellular carcinoma［J］.BMC Gastroenterol，2011，11（5）:53.

［2］Levy DE，Inghirami G.STAT3:a multifaceted oncogene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（27）:10151－10152.

［3］Niu G，Wright KL，Huang M，et al.Constitutive Stat3 activity up－regulates VEGF expression and tumor angiogenesis［J］.Oncogene，2002，21（13）:2000－2008.

［4］Liu Y，Fuchs J，Li C，et al.IL－6，a risk factor for hepatocellular carcinoma:FLLL32 inhibits IL－6－induced STAT3 phosphorylation in human hepatocellular cancer cells［J］.Cell Cycle，2010，9（17）:3423－3427.

［5］Matsui T，Kinoshita T，Hirano T，et al.STAT3 down－regulates the expression of cyclin D during liver development［J］.J Biol Chem，2002，277（39）:36167－36173.

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Effects of an Inhibitor of Signal Transducer and Activator of Transcription 3，WP 1066，on the Biological Characteristics of Hepatocellular Carcinoma

ZHANG Jubo GUO Kun CHEN Yi GE Ningling

REN Zhenggang Department of Hepatic Oncology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China

Objective:To explore the effects of an inhibitor of signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3），WP1066，on the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma（HCC）cells in vitro and in vivo.Methods:The expression level and phosphorylation level of STAT3 in HCC cell lines with different malignant potential were detected by Western blotting and Transwell method.The antitumor activities of WP1066 and related mechanisms were studied in HCC cell line MHCC－97H and also in a subcutaneous HCC model in nude mice.Results:STAT3 phosphorylation level was significantly higher in HCC cell lines with higher malignant potential.WP1066 significantly inhibited cell proliferation and invasion in MHCC－97H.WP1066 also significantly inhibited the growth of tumor in nude mice HCC model.Conclusions:WP 1066 can suppress the proliferation and invasion of HCC through inhibition of the phosphorylation level of STAT3.

Hepatocellular carcinoma； Inhibitor； Signal transducer and activator of transcription 3； Proliferation； In－vasion

R735.7

A

国家自然科学基金资助项目（编号:30872505、81172275）

任正刚，E－mail:ren.zhenggang＠zs－hospital.sh.cn