代谢组学及其在阿尔茨海默病研究中的应用

刘秀勤 王德才 (哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江 哈尔滨 150081)

代谢组学〔1〕是通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)代谢产物图谱及其动态变化，研究生物体系的代谢网络的一种技术，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴“组学”。与其他三种组学研究的DNA、RNA和蛋白质等生物大分子不同，代谢组学是对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究。近年来，代谢组学相关技术发展迅速，已广泛应用到毒理学〔2〕、营养学〔3〕、植物学〔4〕、微生物学〔5〕、药物研发〔6〕、疾病研究〔7〕、功能基因组学〔8〕等领域。阿尔茨海默病(AD)是一种原因不明的以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的中枢神经系统退行性疾病，典型病理改变为老年斑和神经纤维缠结的形成。AD病因复杂，其发病机制至今仍然不明。近年来，一些学者〔9〕对AD的生物学指标进行了研究，希望能够找到早期诊断AD的标志物并探明其发病机制。代谢组学运用高通量、高敏感的分析技术，结合化学计量学方法，分析体液中的代谢产物，可以将所有代谢物的信息整合到一起，通过比较其代谢特性，寻找出早期敏感的生物标志物，能够帮助分析病变过程和辅助临床诊断。本文就代谢组学及其在AD生物标志物研究中的现状做一综述。

1 代谢组学的研究概况

代谢组学多应用在药物研发和疾病研究等领域研究动物体液或组织。Fiehn等〔1〕将其定义为对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析，多应用于植物和微生物领域研究细胞的代谢组学。代谢组学技术能够将基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物上放大，从而使检测更为容易。根据研究对象和研究目的的不同，Fiehn〔10〕将代谢组学分为代谢物靶标分析、代谢轮廓分析、代谢组学及代谢物指纹分析等四个层次，研究的样品主要包括尿液、血液、唾液以及细胞或组织的提取液等。代谢组学的研究一般包括样品的采集和制备、代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和途径分析等步骤〔11〕。

1.1 样品的采集及制备 在采集样品之前，就要设计好样本的采集时间、种类、部位、样本量和采集样品的器材等，并且采集样品时要有严格的质量控制，尽可能在相同的条件下采集样本，使实验误差减到最小。代谢产物的变化会影响分析结果，处理样品时应抑制残留酶的活性，避免发生氧化，采用冰冻、液氮降温或冷冻干燥技术保存样品〔12〕。根据研究目的和分析技术的不同，样品预处理的方法也各不相同。磁共振(NMR)分析技术对样品的处理比较简单，控制样品的pH值、选用不同的缓冲液即可〔13〕。气相色谱质谱(GC-MS)技术需对挥发性较小的化合物进行衍生化，以增加其挥发性，扩大化合物的检测范围〔13〕。高效液相色谱质谱(HPLC-MS)联用技术通常根据样品的性质以及相似相溶原理，利用水和有机溶剂(甲醇、己烷等)分别提取，从而把非极性和极性物质分开〔14〕。由于特定的提取条件只适于某类化合物，目前尚无一种普适性的提取方法，故应根据不同的化合物选择不同的预处理方法制备样品。

1.2 代谢组学数据的采集 样本预处理后，应选择适当的分析方法检测其中的代谢产物，进行代谢组数据的采集。目前多种分析技术〔15〕(色谱、质谱、NMR、电化学、毛细管电泳等)已经应用到代谢组学的研究中，表1比较了代谢组学研究中常用分析技术的各自优势和适用范围。其中色谱-质谱方法兼备色谱的高分离度、高通量及质谱的普适性、高灵敏度和特异性，1HNMR对含氢的代谢产物具有普适性，因此，色谱-质谱联用技术和NMR技术是目前代谢组学研究中最主要的分析工具〔16〕。

表1 代谢组学研究中常用分析技术的比较

1.3 代谢组学数据的分析 由分析仪器获得的元数据经适当的预处理〔21〕(包括滤噪、峰检测、峰匹配、标准化、归一化和重叠峰解析等)得到大量的多维的数据信息，需进一步借助化学计量学方法对代谢物进行全面分析。最常用的是模式识别技术，包括非监督学习方法和有监督学习方法。非监督学习方法〔16〕主要用于从原始谱图信息或预处理后的信息中对样品进行分类，不需相关样品分类的任何背景信息，并将获得的分类信息与样本的原始信息进行比较，建立代谢产物与这些原始信息的联系，筛选出相关的标记物，考察其代谢途径，主要包括主成分分析(PCA)〔22〕、聚类分析(CA)〔23〕、非线性映射(NLM)〔24〕等。有监督学习方法〔16〕主要用于类别间的分类，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。主要包括神经网络(NN)〔25〕、偏最小二乘法(PLS)〔26〕、偏最小二乘法-判别式分析(PLS-DA)〔27〕等。其中PCA和PLSDA是代谢组学研究中最常用的模式识别方法，这两种方法通常以得分图获得对样品分类的信息，载荷图获得对分类有贡献变量及其贡献大小，从而用于发现可作为生物标记物的变量〔16〕。代谢组学分析还需要各种代谢途径和生物化学数据库，数据库中每种代谢产物都有其相应的化学、临床、分子生物学和生化数据〔16〕。检索相关代谢组学数据库，同时结合医学生物学相关理论，向代谢终点的上游追溯，能够探索出生物标志物的代谢途径或通路，进而了解疾病的发病机制。一些生化数据库〔28〕如连接图数据库 (Connections Map DB)、京都基因与基因组百科全书 (KEGG)、METLIN、I-RIS、AraCyc、PathDB、生物化学途径(ExPASy)、Duke博士植物化学和民族植物学数据库、Arizona大学天然产物数据库等，可供未知代谢物的结构鉴定或用于已知代谢物的生物功能解释〔11〕。包含生物体代谢物组信息以及代谢物定量数据较多的数据库有人类代谢组数据库、ChemSpider数据库，但目前尚无功能完备的数据库。

2 AD概述

2009年AD国际组织发布目前全世界有3 500多万痴呆症患者，未来患者人数将每20年翻一番。国际上，将老年期痴呆分为AD、血管性痴呆和混合性痴呆等，其中60% ～80%为AD患者〔29〕。AD典型病理改变为大脑皮层及脑区的纤维蛋白沉积，即细胞外间隙的β淀粉样蛋白(Aβ)和细胞内多聚Tau蛋白的沉积，两者在病理形态学上分别表现为老年斑和神经纤维缠结。AD是一种中枢神经退行性疾病，发病机制尚不清楚，但是有多种学说〔30〕，如基因突变和多态性学说、胆碱能假说、tau蛋白学说、Aβ沉积假说、应激适应性衰竭假说、自由基损害假说、炎症机制假说等。

AD起病隐匿，进展缓慢，逐渐表现出记忆力下降、认知功能损害、精神行为异常等症状，当出现明显痴呆症状时临床诊断没有太大困难，但此时病情已无法逆转，失去了治疗时机。AD在发病早期一些分子靶标的改变早于其病理改变，更早于临床症状的出现〔31〕，为此，国内外研究者采用不同的检测方法和技术〔32〕对AD可能的生物标志物进行了大量的研究，但是到目前为止，还没有找到一种可靠的、特异的、早期敏感的AD生物标志物，对其进行早期诊断。生物学标志物存在于脑脊液、血液和尿液等标本中，其中脑脊液直接和中枢神经系统的细胞外间隙相连，脑内生物学的变化会在脑脊液中反映出来〔33〕。许多学者研究了脑脊液内可能的标志物，主要集中在Aβ、总Tau蛋白(T-Tau)和磷酸化Tau蛋白(P-Tau)，检测手段多为酶联免疫吸附试验和蛋白组学技术〔34〕，运用代谢组学技术来探索AD生物标志物的研究还不多。

3 代谢组学在AD标志物筛选中的应用

代谢组学在临床疾病中的应用主要包括生物标志物的发现、疾病的诊断、治疗和预后判断〔35〕，但其最广泛的应用是发现与疾病诊断和治疗相关的代谢标志物〔16〕。代谢组学从机体的动态代谢途径寻找标志物，将基因和蛋白质表达的微小变化在代谢物上放大，检测患者体内所有的小分子代谢产物，从而使检测更为容易。生物标志物是疾病预防和诊断的基础，这提示可以寻找更多的标志物达到早期诊断和早期治疗的目的。近年来，随着代谢组学的出现和发展，一些学者尝试运用代谢组学技术寻找能够早期诊断AD的生物学标志物(表2)，希望在AD发生的早期诊断出该病，加以及时的治疗和干预。

表2 代谢组学分析技术在AD生物标志物筛选中的应用

4 展望

代谢组学尚处于初始阶段，其分析技术还不完善，目前还未找到一致的、早期的、敏感的、特异性强的生物标志物来预测和诊断AD。今后需进一步发展代谢组学的各种分析技术，采用多种联合技术，通过多个角度、多个层次，筛选并解析所有的谱峰，从整体上研究机体代谢的全部过程及代谢组分，寻找高灵敏和特异的AD生物标志物。近年来，对AD患者尿液代谢组学的研究几乎是一片空白，利用代谢组学新的研究方法，对尿液全组分进行分析，寻找AD早期标志物也是其发展方向。

1 Fiehn O，Kopka J，D¨ormann P，et al.Metabolite profiling for plant functional genomics〔J〕.Nat Biotechnol，2000;18(11):1157-61.

2 Craig A，Sidaway J，Holmes E，et al.Systems toxicology:integrated genomic，proteomic and metabonomie analysis of methapyrilene induced hepatotoxicity in the rat〔J〕.J Proteome Res，2006;5(7):1586-601.

3 Solanky KS，Bailey NJ，Beckwith-Hall BM，et al.Biofluid1H NMR-based metabonomic techniques in nutrition research-metabolic effects of dietary isoflavones in humans〔J〕.J Nutr Biochem，2005;16(4):236-44.

4 Lubbe A，Pomahacová B，Choi YH，et al.Analysis of metabolic variation and galanthamine content in Narcissus bulbs by1H NMR〔J〕.Phytochem Anal，2010;21(1):66-72.

5 Gao P，Shi C，Tian J，et al.Investigation on response of the metabolites in tricarboxylic acid cycle of Escherichi coli and Pseudomonas aeruginosa to antibiotic perturbation by capillary electrophoresis〔J〕.J Pharm Biomed Anal，2007;44(1):180-7.

6 Robertson DG，Reily MD，Baker JD.Metabonomics in pharmaceutical discovery and development〔J〕.J Proteome Res，2007;6(2):526-39.

7 Wang DC，Sun CH，Liu LY，et al.Serum fatty acid profiles using GC-MS and multivariate statistical analysis:potential biomarkers of Alzheimer's disease〔J〕.Neurobiol Aging，2010〔Epub ahead of print〕.

8 King RD，Whelan KE，Jones FM，et al.Functional genomic hypothesis generation and experimentation by a robot scientist〔J〕.Nature，2004;427(6971):247-52.

9 Hansson O，Zetterberg H，Vanmechelen E，et al.Evaluation of plasma Abeta(40)and Abeta(42)as predictors of conversion to Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment〔J〕.Neurobiol Aging，2010;31(3):357-67.

10 Fiehn O.Metabolomics--the link between genotypes and phenotypes〔J〕.Plant Mol Biol，2002;48(1-2):155-71.

11 许国旺.代谢组学-方法与应用〔M〕.北京:科学出版社，2008:8-14.

12 Price KE，Vandaveer SS，Lunte CE，et al.Tissue targeted metabonomics:metabolic profiling by mlcrodialysis sampling and microcoil NMR〔J〕.J Pharm Biomed Anal，2005;38(5):904-9.

13 林鲁霞，季 虹，荣海钦.代谢组学及其在糖尿病研究中的应用〔J〕.国际内分泌代谢杂志，2010;30(z1):19-22.

14 Bruce SJ，Jonsson P，Antti H，et al.Evaluation of a protocol for metabolic profiling studies on human blood plasma by combined ultra-performance liquid chromatography/mass spectrometry:From extraction to data analysis〔J〕.Anal Biochem，2008;372(2):237-49.

15 Dettmer K，Aronov PA，Hammock BD.Mass spectrometry-based metabolomics〔J〕.Mass Spectrom Rev，2007;26(1):51-78.

16 许国旺，路 鑫，杨胜利.代谢组学研究进展〔J〕.中国医学科学院学报，2007;29(6):701-11.

17 Dumas ME，Maibaum EC，Teague C，et al.Assessment of analytical reproducibility of1H NMR spectroscopy based metabonomics for largescale epidemiological research:the INTERMAP study〔J〕.Anal Chem，2006;78(7):2199-208.

18 Kind T，Tolstikov V，Fiehn O，et al.A comprehensive urinary metabolomic approach for identifying kidney cancer〔J〕.Anal Biochem，2007;363(2):185-95.

19 Yin P，Zhao X，Li Q，et al.Metabonomics Study of intestinal fistulas based on ultraperformance liquid chromatograpby coupled with Q-TOF mass spectrometry(UPLC/Q-TOF MS)〔J〕.J Proteome Res，2006;5(9):2135-43.

20 Hirayama A，Kami K，Sugimoto M，et al.Quantitative metabolome profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry〔J〕.Cancer Res，2009;69(11):4918-25.

21 Katajamaa M，Oresic M.Data processing for mass spectrometry-based metabolomics〔J〕.J Chromatogr A，2007;1158(1-2):318-28.

22 Wagner S，Scholz K，Sieber M，et al.Tools in metabonomics:an integrated validation approach for LC-MS metabolic profiling of mercapturic acids in human urine〔J〕.Anal Chem，2007;79(7):2918-26.

23 Keun HC，Ebbels TM，Bollard ME，et al.Geometric trajectory analysis of metabolic responses to toxicity can define treatment specific profiles〔J〕.Chem Res Toxieol，2004;17(5):579-87.

24 Holmes E，Antti H.Chemometric contributions to the evolution of metabenomics:mathematical solutions to characterising and interpreting complex biological NMR spectra〔J〕.Analyst，2002;127(12):1549-57.

25 Lutz U，Lutz RW，Lutz WK.Metabolic profiling of glucuronides in human urine by LC-MS/MS and partial leastsquares discriminant analysis for classification and prediction of gender〔J〕.Anal Chem，2006;78(13):4564-71.

26 Trygg J，Holmes E，Lundstedt T.Chemometrics in metabonomics〔J〕.J Proteome Res，2007;6(2):469-79.

27 Wang C，Kong H，Guan Y，et al.Plasma phospholipid metabolic profiling and biomarkers of type 2 diabetes mellitus based on high-performance liquid chromatography/eleetrospray mass spectrometry and multivariate statistical analysis〔J〕.Anal Chem，2005;77(13):4108-16.

28 Robertson DG，Reily MD，Baker JD.Metabonomics in pharmaceutical discovery and development〔J〕.J Proteome Res，2007;6(2):526-39.

29 Manzano S，González J，Marcos A，et al.Experimental models in Alzheimer's disease〔J〕.Neurologia，2009;24(4):255-62.

30 马 英，曹云鹏.阿尔茨海默病的神经免疫炎症发病机制及其治疗研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(21):3200-4.

31 牛丰南，孙宗正.阿尔茨海默病早期诊断的分子靶标研究进展〔J〕.国际神病学神经外科学杂志，2009;36(1):86-90.

32 Simonsen AH，Hansson SF，Ruetschi U，et al.Amyloid beta1 ～40 quantification in CSF:comparison between chromatographic and immunochemical methods〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，2007;23(4):246-50.

33 姚 洁，王培昌.脑脊液生物学标志物的检测在阿尔茨海默病诊断中的应用〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(16):1631-5.

34 Giannakis E，Hung LW，Camacaro KP，et al.Analysis of Abeta interactions using Protein Chip technology〔J〕.MethodsMol Biol，2008;494:71-86.

35 Schnackenberg LK，Beger RD.Monitoring the health to disease continuum with global metabolic profiling and systems biology〔J〕.Pharmacogenomics，2006;7(7):1077-86.

36 任进民，党志敏，李 风，等.血浆中脱氢表雄酮硫酸酯检测对阿尔茨海默病的临床意义〔J〕.脑与神经疾病杂志，2010;18(3):161-3.

37 Du C，Ramaley C，McLean H，et al.High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry for the detection of amyloid beta peptide related with Alzheimer's disease〔J〕.J Biomol Tech，2005;16(4):356-63.

38 Li NJ，Liu WT，Li W，et al.Plasma metabolic proflling of Alzheimer's disease by liquid chromatography/mass spectrometry〔J〕.Clin Biochem，2010;43(12):992-7.

39 Greenberg N，Grassano A，Thambisetty M，et al.A proposed metabolic strategy for monitoring disease progression in Alzheimer's disease〔J〕.Electrophoresis，2009;30(7):1235-9.

40 罗柏宁，张 波，钱彩韵，等.磁共振氢质子波谱对轻度阿尔茨海默病患者的评估作用〔J〕.中国临床康复，2004;8(31):6874-5.

41 Salek RM，Xia J，Innes A，et al.A metabolomic study of the CRND8 transgenic mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.Neurochem Int，2010;56(8):937-47.

42Tukiainen T，Tynkkynen T，M¨akinen VP，et al.A multi-metabolite analysis of serum by1H NMR spectroscopy:early systemic signs of Alzheimer's disease〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;375(3):356-61.

43 Kaddurah-Daouk R，Rozen S，Matson W，et al.Metabolomic changes in autopsy-confirmed Alzheimer's disease〔J〕.Alzheimers Dement，2011;7(3):309-17.