P17-BMP2多肽促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

李佳滨 张文杰 崔福斋 杜晓岩

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种存在于骨髓内的成体干细胞，因具有多向分化潜能和高增殖活性，目前已成为骨组织工程中理想的种子细胞。BMSCs可在成骨诱导培养条件下向成骨细胞分化[1]。研究证实，骨形态发生蛋白 2（Bone morphogenetic protein 2，BMP2）是目前成骨诱导活性最强的骨形态发生蛋白之一，属于TGF-β超家族成员[2]。因纯化天然BMP2程序复杂，不易获得，所以基因重组的BMP2研发是目前研究的热点。本实验根据BMP-2的核心功能区氨基酸序列，合成一条含有17个核苷酸的P17-BMP2，旨在观察P17-BMP2联合成骨诱导剂促使BMSCs向成骨细胞分化的能力。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

P17-BMP2多肽（清华大学合成提供）；DMEMLG培养基、DMEM-HG培养基、胰蛋白酶（HyClone公司，美国）；青霉素、链霉素、特级胎牛血清(Gibco公司，美国)；β-甘油磷酸二钠（Sigma 公司，美国）；地塞米松（Sigma公司，美国）；抗坏血酸（Sigma公司，美国）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；CCK-8 试剂（日本同仁化学研究所）；荧光显微镜（Olympus IX70，日本）；核酸蛋白分析仪（DU-800，美国）；荧光定量PCR仪（MX3000P，美国）；高速冰冻离心机（Beckman 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分离培养及分组

取4周龄Wistar雄性大鼠9只（上海第九人民医院动物实验中心提供），脱颈处死，75%乙醇浸泡消毒5min，无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，止血钳压碎，5 mL的DMEM完全培养基（含20%胎牛血清，100 mg/mL青、链霉素）冲洗骨髓腔，使骨髓细胞充分分散，将收集的骨髓用吸管打匀，加入离心管，1500 r/min离心5min，弃上清，用适量DMEM打匀制成单细胞悬液，取悬液1 mL（1只大鼠一培养皿）至 25 cm培养瓶，置于 37℃、5%CO2孵育箱中，48 h后换液，以后每 3天换液1次。待细胞汇合成80%～90%单层后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，继续培养，取第3代的细胞备用。

分4组培养：对照组（A组）、成骨诱导组（B组）、成骨诱导+P17-BMP2组（C组）、单纯P17-BMP2组（D组）。A组：采用普通DMEM培养基培养；B组：含地塞米松10-7mol/L、Vit C 10 mg/L及β-甘油磷酸钠（β-sodium glycerophosphate，β-GP）10 mmol/L 的DMEM培养基培养；C组：成骨诱导液+P17-BMP2（10 μg/mL）培养；D 组：含 P17-BMP2（10 μg/mL）的DMEM培养基培养。

1.2.2 细胞增殖测定

取第3代对数生长期的BMSCs离心稀释吹打成浓度为1×104cells/mL的均匀单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔细胞悬液量为100μL，设3个复孔，同时设立空白对照孔（加培养基100μL），孔板周围加PBS 100μL保持湿度。共接种4个96孔板，放入CO2培养箱中培养，24h后换液，以后3 d换液一次，于培养第1、3、5、7天取出，每孔加入CCK-8试剂10μL，于CO2培养箱中继续孵育4h后，酶联免疫检测仪测定各组的吸光光度值，取3个孔OD平均值，检测波长为450 nm。采集3只大鼠的骨髓重复3次。

1.2.3 碱性磷酸酶染色

取第3代细胞，接种于24孔培养板，各组培养基培养7 d。PBS洗涤3次，放置4℃固定液，流水冲洗，晾干；将二甲基甲酰胺溶解底物后，倒入缓冲液中；再加入固紫B混匀；将工作液置于37℃水温箱45min，流水冲洗；显微镜观察。采集3只大鼠的骨髓重复3次。

1.2.4 实时荧光定量PCR

根据NCBI Genebank序列行引物设计，引物由上海英潍捷基有限公司合成并经质量检测，开盖前短暂离心，加入经DEPC处理的ddH2O稀释至浓度为 10 nmol/μL，-20℃储存备用。OPN引物序列：Forward primer 5-CATCAGAGCCACGAGTTTCA-3；Reverse primer 5-TCAGGGCCCAAAACACTATC-3；OCN引物序列：Forward primer 5-TGCCTTCTGTCTGGGTGTCC-3；Reverse primer 5-GCTGTGCCGTCCATACTTTCG-3；Runx2引物序列 ：Forward primer 5-CAACATCTCCACATCATTAG-3；Reverse primer 5-TTATTACCCTCTCAAACACTG-3；β-Actin引物序列：Forward primer 5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAACTA -3；Reverse primer 5-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3。

培养7 d、14 d后分别收集细胞，使用Trizol一步法抽提细胞总RNA。每组各3个复孔，Q-PCR重复检测。采集3只大鼠的骨髓重复3次。

1.3 统计学分析

采用Origin 8.0统计软件分析，将以上数据进行t检验，数据以（均数±标准差）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs形态学特征

荧光显微镜下观察，细胞接种24h即可贴壁，48 h后细胞贴壁呈成纤维细胞样外观，3～7 d细胞处于对数生长期，增殖明显，呈单层生长。C组用含P17-BMP2的成骨诱导培养基培养5～7 d后，细胞形态由梭形转变为椭圆或多角形，出现无规则堆积，融合生长时细胞变短，形态扁平，核及核仁清晰可见（图 1）。

图1 各组BMSCs体外诱导7 d后的组织学观察（倒置相差显微镜，40×）Fig.1 The histological observation of BMSCs in each group 7 days after induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

2.2 细胞增殖测定

细胞培养第 1、3、5、7天时，通过 CCK-8对大鼠BMSCs增殖进行检测，发现与A组相比，D组对大鼠BMSCs增殖无影响，而B组对BMSCs细胞增殖起促进作用，C组细胞增殖能力显著提高（P<0.05），差异具有统计学意义。在增殖第7天时，成骨诱导组对细胞增殖作用不明显，与对照组相比无统计学差异（P>0.05）（图 2）。

2.3 碱性磷酸酶染色

体外诱导7 d，各组碱性磷酸酶染色均为阳性，但染色强度有差异，C组>B组>D组>A组。显微镜下观察可见阳性区域胞质内有紫色颗粒（图3）。

图2 各组细胞生长曲线Fig.2 Cell growth curve of each group

图3 各组BMSCs体外诱导7 d后AKP染色大体观及镜下观察（倒置相差显微镜，40×）Fig.3 The gross and histological observation of BMSCs by AKP staining 7 days after induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

图4 各组BMSCs体外培养第7、14天成骨特异性基因OPN、OCN、Runx2的表达Fig.4 The expression of OPN,OCN and Runx2 of each group at the 7th and 14th day after induction

2.4 Q-PCR检测OCN、OPN、Runx2的mRNA表达

Q-PCR结果显示，在诱导第7天，B、C、D组均表达成骨特异性基因，与对照组相比，B组和C组中所有检测基因的表达均显著提高（P<0.05），而D组与对照组相比无显著差异。在诱导第14天时，B组和C组中所有检测基因与对照组相比有显著差异（P<0.05）；D组与对照组相比，OCN和OPN的表达有显著差异（P<0.05）（图4）。

3 讨论

BMP2属于TGF-β超家族中的一员，因其诱导成骨活性最强，可促进骨形成并分泌特异性成骨细胞产物，如 COL、OPN、OCN 等。研究表明，BMP-2的信号传导通过Smads途径或MAPK途径，激活转录因子Runx2和Osx，从而启动成骨细胞特异性的基因表达[3-4]。以往研究表明，在成骨过程中，BMSCs在局部BMP2的刺激下发生化学趋向、聚集、分化形成软骨和骨[5-6]。天然人BMP2成熟肽由114个氨基酸组成，但真正发挥骨诱导作用的只是由20余个氨基酸组成的核心结构。随着分子生物学技术的发展，基因重组技术的成功应用，解决了BMPs生产成本高和产量低的问题。近10年来，人们利用分子基因工程和生物学等技术开展了基因重组BMP2的工作，但目前重组BMP2临床使用费用高，提取方法繁杂，而且存在潜在的致癌风险，难以满足临床和研究的需求。本实验中P17-BMP2的核心功能区是由17个氨基酸组成的寡肽BMP2，其活性点易于暴露，合成方法简单，可以通过特定的细胞通讯与信息传递对细胞的成骨定向分化起调控作用，具有一定骨诱导性。与rhBMP-2相比较，短链多肽相对于蛋白质有很多优点：①小分子的多肽可以用多肽合成仪快速大规模地制备，克服基因工程技术合成大分子蛋白质时工艺复杂、价格昂贵的弊端；②小分子多肽结构简单，其活性位点暴露充分，并易与细胞的受体充分结合，易于合成，能生产出不同剂型的多肽，且生物学活性和稳定性较好。前期实验证实了P17-BMP2具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用，并筛选出P17-BMP210 μg/mL的剂量对大鼠BMSCs的成骨分化作用最为明显。大多数诱导实验中使用的 BMP2 为 20～200 μg/mL[7-9]，段智霞等[10]研究显示P24-BMP2活性多肽在体外能诱导BMSCs向成骨方向分化，最佳剂量为200 μg/mL，低于此剂量诱导效果不明显，高于此剂量诱导效果无明显增强，而副作用增加明显。本实验结果与以往实验相似。

BMSCs成骨诱导的方法很多，既往的研究已证明，BMSCs在矿化培养基（地塞米松、甘油磷酸钠和L-抗坏血酸）培养下可向成骨细胞分化。含有地塞米松、β-甘油磷酸钠和L-抗坏血酸的矿化培养基（OS培养基）[11]被认为是经典的成骨诱导培养基。Rickard等[12]研究表明，BMP和DEX的联合作用比单纯使用BMP的骨诱导性高，认为BMP可能并不单独发生作用，在整个骨诱导过程中可能需要激素的协同作用。基于以上结果，本实验中将P17-BMP2与成骨诱导剂联合应用，发现成骨诱导组和单纯P17-BMP2组在第7天、第14天表达成骨特异性基因OCN、OPN及Runx2，当P17-BMP2与成骨诱导剂联合应用时成骨特异性基因OCN、OPN及Runx2的表达与其他各组都有显著性差异。这说明在成骨分化中P17-BMP2与成骨诱导剂联合应用比单纯应用P17-BMP2因子的骨诱导性高，并可上调特异性成骨细胞产物OCN、OPN及Runx2的mRNA表达，体外诱导7 d后碱性磷酸酶染色结果同样证实了这一点。为了能更好证明P17-BMP2多肽的骨诱导活性和成骨作用，我们下一步实验将以P17-BMP2复合在生物支架材料上，观察其在体内的异位成骨能力。

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