软骨形态发生蛋白1诱导瘢痕成纤维细胞表达软骨表型的实验研究

马晓飞 张艳 柴岗 朱明

体内广泛分布的真皮成纤维细胞（DFs）与软骨细胞都来源于中胚层间质细胞，与软骨细胞不同的是，DFs保留了中胚层间质细胞增殖力强的特性，多次传代后仍能保持强大的增殖力[1]。以往认为DFs属于终末分化细胞，只能构建真皮组织，不能向其他组织细胞分化。近来研究发现，DFs中存在间充质干细胞，具有向软骨、骨、脂肪、神经等组织分化的潜能[2-4]。研究发现，在CDMP1作用下，DFs可向软骨细胞分化并表达软骨特异性基质[5-6]。Zhao等[7]进一步利用犬DFs进行半月板的自体构建，并成功修复了犬半月板缺损。临床上大面积烧伤及头颈部烧伤患者常伴有耳软骨的烧伤缺损，切取自体肋软骨进行耳重建创伤较大。DFs的软骨分化潜能为耳缺损的重建提供了一条新途径。但是，大面积烧伤患者皮源紧张，无多余皮肤可取，切取正常皮肤亦会增加感染风险，这在一定程度上限制了DFs作为软骨构建种子细胞的进一步研究和应用。文献证明，瘢痕成纤维细胞同样具有强大的体外增殖能力及基质分泌能力，能够分泌大量胶原及蛋白聚糖，而后者是构成软骨细胞外基质的主要成分[8-9]。研究表明，瘢痕成纤维细胞具有部分干细胞的特性，在特定条件下能够表达干细胞相关标志物，并能够向其他组织细胞转化，具有类似于DFs样的分化潜能[10-11]。

因此，本实验利用CDMP1为诱导因子，探索瘢痕成纤维细胞的软骨诱导分化潜能，评价其作为软骨种子细胞的可行性，为瘢痕成纤维细胞用于烧伤后耳软骨缺损的修复进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CDMP1（Research Diagnostics公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Worthington公司，美国）；DMEM培养液（Gibco 公司，美国）；鼠抗 ColⅠ、ColⅡ、Sox9、Aggrecan抗体（Chemicon公司，美国）；FITC兔抗鼠IgG(Oncogene 公司，美国)；Hoechst(1:500，Sigma 公司，美国)；Trizol(Invitrogen公司，美国)；RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）；封闭缓冲液、链抗生物素球蛋白-碱性磷酸酶（Pierce公司，美国）。

恒温CO2培养箱（Forma公司，美国）；普通台式离心机、高速冷冻离心机（Heraeus公司，美国）；倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；电泳仪(天能科技有限公司)；热循环仪(Biometra公司，美国)；DU2-640紫外分光光度计、流式细胞仪（Beckman公司，美国）；100 mm培养皿、离心管（FALCON Franklin LakesNT公司，美国）。

1.2 取材与细胞培养

取上海第九人民医院整复外科手术切除的废弃瘢痕组织，超净台内去除表皮及皮下组织，剩余瘢痕增生部分剪碎移入离心管，加入10倍于组织体积的0.3%的Ⅰ型胶原酶，37℃、3 h、100目细胞滤器过滤后离心，2000 r/min，10min，弃上清，加入 10%FBS的DMEM培养液混浴，接种至100 mm的培养皿。待细胞融合至80%时，以1×104cells/cm2密度传代，体外扩增至第4代进行诱导培养。

1.3 细胞诱导及分组

配制CDMP1诱导液（2%胎牛血清F-12培养液，CDMP1终浓度为100 ng/mL）。取第4代瘢痕成纤维细胞，无血清培养液孵育24h后更换为诱导液，每3天换液一次，诱导7 d；阴性对照组加入含2%FBS的F-12培养液常规培养；取上海第九人民医院整复外科患者肋软骨切除术后部分软骨组织，分离软骨细胞常规培养，作为阳性对照组。

1.4 形态观察

倒置显微镜观察诱导前后细胞形态，Image Plus软件分析诱导前后细胞长径与短径，计算细胞长宽比例。

1.5 免疫荧光检测

细胞诱导7 d后，4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗，Triton破膜15min，10%羊血清封闭30min，加入鼠抗 ColⅠ、ColⅡ、Sox9、Aggrecan 抗体，4 ℃过夜，PBS漂洗，FITC兔抗鼠IgG孵育30min，PBS漂洗，Hoechst（1:500）染核 2～5min，PBS 漂洗后封片，荧光显微镜观察，胞浆内绿色荧光为阳性表达，胞核为蓝色荧光。

1.6 RT-PCR检测

Trizol提取对照组和实验组总mRNA，检测ColⅠ（F-tgttcagctttgtggacctc，R-cttggtctcgtcacagatca；236 bp）、ColⅡ （F-cttgggcacctcgggctcctttag， R-tccccggcactcctggcactgat；510 bp）、Sox9（F-gaacgcacatcaagacggag，R-tctcgttgatttcgctgctc；631 bp）、Aggrecan（F-tcctggaagctcttctcact，R-atgcccaagactaccagtgg；510 bp）的表达，以β-actin（318 bp）作为内参照。根据RTPCR试剂盒操作说明进行逆转录和扩增反应，反应条件：94℃变性，55℃退火，35个循环。

1.7 Western blot检测

收集诱导7 d后的细胞，提取总蛋白。加入等体积2倍的十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液，β-硫基乙醇 2μL/100μL。 100 ℃沸水变性 10min，冷却至室温上样。聚丙烯酰胺凝胶电泳10 mA，3～4h。电泳结束后90 V、4℃转膜2 h，4℃封闭过夜。37℃依次加入鼠抗一抗（1:500）生物素化二抗 IgG（1∶500）、链抗生物素球蛋白-碱性磷酸酶（1∶3400）进行杂交，逐级杂交放大后滴加显色底物，显色后进行结果分析。

1.8 Micromass法诱导与检测

取第3代瘢痕成纤维细胞，调整细胞至密度为5×107cells/mL，以每滴 15μL 滴至培养皿底部，37 ℃、95%CO2、5%O2培养箱内放置2 h，加入诱导液，诱导及对照组处理同上。诱导7 d后进行免疫组织化学染色和Safranine-O染色，检测ColⅡ及软骨基质的表达[12]。

1.9 统计分析

利用 SPSS 11.0 软件（Chicago，IL）对组间数据进行t检验，P<0.05认为差别具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞诱导前后形态变化

诱导前瘢痕成纤维细胞为长梭形，诱导后长梭形的瘢痕成纤维细胞开始向多角形，不规则形转变，与软骨形态类似。对照组未见明显变化（图1）。Image Plus软件分析显示，诱导后细胞长宽比例为（1.48±0.21）:1，与诱导前的（7.21±1.54）:1 相比，差异有统计学意义（P<0.05）；与正常软骨细胞的（1.31±0.13）:1 相比，差异无统计学意义（P>0.05）（图 2）。

2.2 免疫荧光检测

荧光显微镜观察发现，单层培养的瘢痕成纤维细胞诱导后表达ColⅡ、Sox9和Aggrecan，荧光强度较正常软骨细胞稍弱；未诱导瘢痕成纤维细胞未见ColⅡ、Sox9和Aggrecan表达。诱导前后瘢痕成纤维细胞均表达ColⅠ，诱导后荧光强度较诱导前稍弱，软骨细胞未见ColⅠ表达（图3）。

2.3 RT-PCR检测

CDMP1诱导7 d后，RT-PCR检测到 ColⅡ、Sox9和Aggrecan扩增产物，扩增结果与正常软骨细胞相一致；未诱导组未见ColⅡ和Sox9软骨相关标志物的扩增结果，Aggrecan检测到少量扩增产物；诱导组与未诱导组均出现ColⅠ扩增产物，正常软骨细胞未检测到ColⅠ扩增产物（图4）。

2.4 Western blot检测

瘢痕成纤维细胞经诱导7 d后，Western blot结果显示ColⅡ、Sox9和Aggrecan等软骨特异蛋白表达，诱导后结果与正常软骨细胞相一致，未诱导组未见ColⅡ和Sox9特异蛋白表达，Aggrecan弱表达。诱导组与未诱导组均出现ColⅠ表达，正常软骨细胞未检测到ColⅠ表达（图5）。

2.5 Micromass培养法诱导前后比较

将瘢痕成纤维细胞进行Micromass诱导7 d。HE染色显示整个细胞团块以纤维性组织为主，团块外缘部分细胞出现特征性软骨陷窝。免疫组织化学检测ColⅡ表达情况，发现Micromass团块部分区域出现黄褐色，提示Ⅱ型胶原的表达。Safranine-O染色结果显示细胞团块大部分区域出现红染，外侧颜色深于中央，提示有软骨基质的沉积（图6）。

图1 各组细胞组织学观察（倒置相差显微镜，100×）Fig.1 The histological observation(Inverted phase contrast microscope,100×)

图2 各组细胞长宽比例Fig.2 Cell length/width ratio in each group

图3 免疫荧光检测各组细胞ColⅠ、ColⅡ、Sox9及Aggrecan的表达（免疫荧光显微镜，100×）Fig.3 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by immunofluorescence(Immunofluorescence Microscopy,100×)

图4 RT-PCR检测各组细胞ColⅠ、ColⅡ、Sox9及Aggrecan的表达Fig.4 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by RT-PCR

图5 Western blot检测各组细胞 ColⅠ、ColⅡ、Sox9 及Aggrecan的表达Fig.5 The expression of ColⅠ,colⅡ,Sox9 and Aggrecan of each group detected by Western blot

图6 Micromass诱导7 d后各组HE染色、免疫组织化学染色及Safranine-O染色结果Fig.6 The histological observation of each group after 7 days micromass culture by HE staining,immunohistochemistry and Safranine-O staining

3 讨论

软骨形态发生蛋白（Cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1）[13]是骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）家族中的一类特异性生长因子，是与软骨形态发生和发育最为相关的一类生长因子。CDMP1主要通过调节间质前体细胞的分化，参与正常软骨组织的生长，并促进软骨损伤的修复过程，在软骨的分化发育中起重要调控作用。研究表明，CDMP1能够诱导间充质干细胞向软骨表型分化，并表达特异性软骨基质[14]，是干细胞定向谱系分化的一种高效诱导剂。

真皮成纤维细胞与软骨细胞都来源于中胚层间质细胞。与软骨细胞不同的是，DFs保留了中胚层间质细胞增殖力强的特性，多次传代后仍能保持强大的增殖力，是体内最大的“种子库”。研究表明，DFs并非完全分化的终末体细胞，在特定条件下仍具有向其他谱系细胞分化的能力。Han等[15]采用基因转染的方法将4种基因转入牛的DFs，转染后发现DFs具有干细胞的多向分化潜能，能够向骨、脂肪、软骨、神经等多类型组织细胞分化。Kunihiko等[16]取鼠DFs采用基因转染后进行软骨定向诱导，发现DFs即使在未转变为IPS细胞的前提下仍能够向软骨细胞分化，并表达软骨特异标志物，推测DFs本身可能具有干细胞潜能。CDMP1可直接诱导DFs向软骨细胞转化，并能够在体内成功构建半月板软骨，实现半月板的生物修复，证明了DFs具有软骨分化潜能。

病理性瘢痕的形成是成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积的过程。在一系列细胞生长因子的调控下，瘢痕成纤维细胞增殖力活跃，基质分泌能力旺盛，大量合成胶原及蛋白聚糖等物质，导致瘢痕过度增生。相对于DFs而言，瘢痕成纤维细胞保持了体外培养的高度增殖力，并具有比DFs更强大的分泌能力，能够分泌软骨特异性标志物Aggrecan。特别是对于大面积烧伤伴有耳软骨缺损患者，因皮源紧张导致无皮可取，瘢痕成纤维细胞成为DFs的最佳替代种子细胞。研究表明，瘢痕成纤维细胞不仅具有强大的增殖力，同时具有间充质干细胞的活性，在特定条件下可能具有向其他谱系细胞分化的潜能。Yang等[10]提取瘢痕疙瘩中的成纤维细胞，在特定诱导条件下发现瘢痕成纤维细胞具有干细胞样分化潜能，能够表达神经胶质细胞相关标志物，并能够向神经细胞分化诱导，有望成为一种潜在的组织修复种子细胞。Moon等[11]从头皮瘢痕中分离瘢痕成纤维细胞，采用各种诱导体系对瘢痕成纤维细胞进行诱导培养，结果显示瘢痕成纤维细胞能够表达间充质干细胞的标志物 CD13、CD29、CD44、CD90、Fibronectin及Vimentin等，并能够向骨组织细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌腱细胞及上皮细胞等方向分化；在向神经组织分化过程中，瘢痕成纤维细胞在诱导后具有神经干细胞的特性，表达神经元干细胞的标志物，并向神经胶质细胞分化，证明了瘢痕成纤维细胞具有多向分化潜能，可能成为多组织修复的替代细胞。ColⅡ和Aggrecan是目前已证明的软骨细胞最特异的标记物[17]，瘢痕成纤维细胞本身并不表达ColⅡ。在本实验的诱导体系下，单层培养的瘢痕成纤维细胞经CDMP1诱导7 d后，细胞形态由长梭形向多角形转变，细胞长宽比例降低，与软骨细胞差异无统计意义。免疫荧光、RT-PCR、Western blot等均证实诱导后的瘢痕成纤维细胞表达ColⅡ，且诱导后瘢痕成纤维细胞Aggrecan表达增强，证实瘢痕成纤维细胞向软骨细胞的转分化。同时，诱导后瘢痕成纤维细胞出现Sox9的表达，Sox9是调节软骨细胞分化与软骨基质合成的重要转录调控因子，提示CDMP1可能通过调控上述基因的作用诱导瘢痕成纤维细胞向软骨细胞分化。为进一步证实上述研究结果，我们又将瘢痕成纤维细胞进行Micromass法培养诱导，诱导7 d后发现，Micromass团块部分瘢痕成纤维细胞出现软骨陷窝结构，由于团块外侧对于培养液接触的优势性，因此出现软骨陷窝结构的瘢痕成纤维细胞多聚集在外侧。免疫组织化学染色显示，细胞团块偏外侧区域出现黄褐色显色，表明瘢痕成纤维细胞ColⅡ的表达，显色区域与出现软骨陷窝结构区域基本一致。Safranine-O染色示细胞团块出现大片红染，表明瘢痕成纤维细胞内外有软骨基质的沉积，进一步证实了瘢痕成纤维细胞向软骨细胞的分化潜能。

本实验证明，在CDMP1诱导下，瘢痕成纤维细胞在单层培养和Micromass培养条件下，均能向软骨细胞表型分化，表达软骨特异性指标，并合成软骨基质，证明瘢痕成纤维细胞具有软骨分化潜能，有望作为烧伤后耳缺损修复的软骨种子细胞。但是，诱导分化后软骨表型的维持时间、诱导体系的优化、诱导分化机制，及组织工程化耳软骨构建等问题还需进一步研究。

[1]Usategui A,del Rey Mj,Pablos JL,et al.Fibroblast abnormalities in the pathogenesis of systemic sclerosis[J].Expert Rev Clin Immunol,2011,7(4):491-498.

[2]Han X,Han J,Ding F,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from bovine embryonic fibroblast cells[J].Cell Res,2011,21(10):1509-1512.

[3]Takahashi K,Okita K,Nakagawa M,et al.Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures[J].Nat Protoc,2007,2(12):3081-3089.

[4]Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblasts by four transcription factors[J].Cell Prolif,2008,41(1):51-56.

[5]Yin S,Cen L,Wang C,et al.Chondrogenic transdifferentiation of human dermal fibroblasts stimulated with cartilage-derived morphogenetic protein 1[J].Tissue Eng Part A,2010,16(5):1633-1643.

[6]Cui L,Yin S,Deng D,et al.Cartilage derived morphogenetic protein 1initiates chondrogenic differentiation of human dermal fibroblast in vitro[J].Natl Med China,2004,84(15):1304-1309.

[7]Zhao G,Yin S,Liu G,et al.In vitro engineering of fibrocartilage using CDMP1 induced dermal fibroblasts and polyglycolide[J].Biomaterials,2009,30(19):3241-3250.

[8]Gauglitz GG.Management of hypertrophic scars and keloids[J].MMW Fortschr Med,2010,152(42):40-43.

[9]Charu A,Zacharyt B,Dimosthenis A,et al.Healing and normal fibroblasts exhibit differential proliferation,collagen production,α-SMA expression,and contraction[J].Ann Biomed Eng,2006,34(4):653-659.

[10]Yang JH,Shim SW,Lee BY,et al.Skin-derived stem cells in human scar tissues:a novel isolation and proliferation technique and their differentiation potential to neurogenic progenitor cells[J].Tissue Eng Part C,2010,16(4):619-629.

[11]Moon JH,Kwak SS,Park G.Isolation and characterization of multipotent human keloid-derived mesenchymal-like stem cells[J].Stem Cells Dev,2008,17(4):713-724.

[12]Chang SH,Oh CD,Yang MS,et al.Protein kinase C regulates chondrogenesis of mesenchymes via mitogen-activated protein kinase signaling[J].J Biol Chem,1998,273(30):19213-19219.

[13]Noriyuki Tsumaki,Kazuhiro Tanaka,Eri Arikawa-Hirasawa,et al.Role of CDMP-1 in skeletal morphogenesis:promotion of mesenchymal cell recruitment and chondrocyte differentiation[J].J Cell Biol,1999,144(1):161-173.

[14]Bai X,Xiao Z,Pan Y,et al.Cartilage-derived morphogenetic protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,325(2):453-460.

[15]Han X,Han J,Ding F,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from bovine embryonic fibroblast cells[J].Cell Res,2011,21(10):1509-1512.

[16]Hiramatsu K,Sasagawa S,Outani H,et al.Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors[J].J Clin Invest,2011,121(2):640-657.

[17]Cheng NC,Estes BT,Awad HA,et al.Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells by a porous scaffold derived from native articular cartilage extracellular matrix[J].Tissue Eng Part A,2009,15(2):231-241.