碱性螺旋－环－螺旋转录因子对视网膜神经细胞分化发育的调控作用△

黄 倞 胡 芳 易敬林

哺乳动物视网膜由于其明确的层次结构和固定的细胞排列，已成为研究中枢神经系统分化发育调控机制的理想模型。其中，小鼠因为与人类基因组的高度相似性而应用最为广泛。小鼠视网膜由6种神经元细胞即视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)、无长突细胞、双极细胞、水平细胞、视锥与视杆感光细胞以及一种Müller胶质细胞组成。Turner等[1]发现这些神经细胞均由具有多向分化潜能的视网膜祖细胞(retinal progenitor cells，RPC)按照固定的顺序分化发育而来，并根据形态和功能的不同进一步分化为众多的细胞亚型。Masland[2]预计视网膜中的细胞亚型应该有50种以上，目前已鉴定明确的细胞亚型有20多种。虽然这些神经细胞及其亚型是如何由RPC分化而来的目前尚不清楚，但随着小鼠转基因和基因敲除(入)技术的发展，碱性螺旋-环-螺旋(basic helixloop-helix，bHLH)转录因子被认为在视网膜神经细胞及其亚型的分化发育和命运选择中发挥着关键作用。Harris[3]、Livesey 等[4]和 Cepko 等[5]通过小鼠基因敲除和以逆转录病毒为载体的基因异位表达研究发现RPC向特定细胞类型的分化过程受到多种转录因子的调控，而bHLH转录因子在其中扮演着重要的角色。目前Ohsawa等[6]认为bHLH转录因子表达于视网膜发育的全过程，在RPC的增殖、分化，视网膜神经细胞的命运选择及发育过程中均发挥着重要作用，其中表达于视网膜发育早期的家族成员决定着RPC的分化方向，而表达于发育后期的家族成员则作用于已分化细胞的发育过程。本文将对bHLH转录因子在视网膜发育过程中对不同类型神经细胞的调控作用加以综述。

1 bHLH转录因子对维持RPC增殖状态的调控作用

在视网膜发育早期，RPC处于不断增殖状态，为各类神经细胞的分化发育提供足够的细胞数量支持。Ohsawa等[6]发现从小鼠胚胎期第10.5天(embryonic day 10.5，E10.5)开始，RPC 进入分化状态并按照固定顺序逐渐分化发育为不同种类的神经细胞，其中最先产生的是RGC，然后依次是无长突细胞、视锥细胞、水平细胞、双极细胞和视杆细胞，最后是Müller胶质细胞。为了满足发育过程中不同种类神经细胞的产生对RPC数量的需求，RPC在视网膜发育过程中处在增殖和分化并存的状态，并一直保持到小鼠出生之后。研究发现在维持RPC增殖和分化的动态平衡中bHLH转录因子发挥着重要的作用，其家族成员Hes1、Hes3和Hes5是调控RPC增殖状态的关键因子。Takatsuka 等[7]和 Lee 等[8]发现Hes1基因突变的小鼠胚胎在RPC增殖受到严重影响的同时，在视网膜和中枢神经系统的其他组织中出现大量异常的早熟神经细胞，并且视网膜中固定的层次排列也因为未分化细胞的发育异常而消失;Deneen等[9]研究发现 Hes5的表达缺失将造成约40%的Müller胶质细胞减少，由于Müller胶质细胞被认为是RPC分化过程中对神经干细胞的一种储蓄过程，在必要的情况下Müller胶质细胞可以发挥神经干细胞的功能而再次分化，因此，在Hes5基因突变小鼠中Müller胶质细胞的大量减少可以解读为RPC增殖的严重不足。并且Hojo等[10]通过基因异位表达研究发现，Hes5的异位表达将显著地促进Müller胶质细胞的产生，再次印证了 Hes5对维持RPC增殖状态的作用。Hatakeyama等[11]的进一步研究发现Hes1、Hes5双基因敲除小鼠表现出较两者单独敲除时更加严重的视网膜发育异常，包括视网膜血管和视神经盘的缺失;同时 Hirata等[12]发现Hes3在RPC中表达并抑制促 RPC分化基因如Mash1等的活性，以此抑制RPC分化而保持RPC的持续增殖状态。由此可见，在视网膜发育过程中多种bHLH转录因子共同参与RPC的增殖与分化过程，对维持RPC的增殖状态起着重要作用。

2 bHLH转录因子对RGC分化发育的调控作用

RGC是视网膜中唯一的传出神经元，负责将感光细胞收集的视觉信息传递至视觉中枢。Hatakeyama等[13]发现小鼠 RGC由 RPC从 E11.5开始分化而来，分化过程中bHLH转录因子Math5是RGC细胞命运选择的关键调控因子。Math5在小鼠视网膜发育早期即存在表达，并在E11.5至E13.5达到高峰，此时也正是部分RPC分化为RGC的时期，Prasov等[14]研究证实 Math5的表达水平将直接决定着RGC 的产生数量。Brown 等[15]和 Wang等[16]通过基因敲除研究发现Math5的表达缺失将造成RGC的数量较正常时减少超过80%。Feng等[17]通过细胞谱系追踪发现，损失的RGC中包括部分原本应分化为RGC的RPC发生细胞命运改变转而分化为无长突细胞和感光细胞，说明Math5的表达直接调控着RPC向RGC或是其他类型神经细胞分化。Brzezinski等[18]虽然发现Math5的表达能促进部分RPC向 RGC 方向分化，但 Liu 等[19]和 Prasov等[20]却认为Math5不足以单独决定RGC的数量，因为Math5的异位表达和过度表达并不能直接促使更多的RGC产生，提示着Math5可能和其他基因共同组成调控网络作用于 RGC的分化发育过程。Liu等[19]和Yang等[21]发现 POU同源结构域基因 Brn3b是Math5的下游基因，广泛表达于RGC中，并对RGC的正常存活和功能维持发挥着重要作用。Badea等[22]和 Chen 等[23]发现当 Brn3b 被特异性敲除时将表现出RGC数量显著减少、轴突发育异常和瞳孔对光反射异常等表型。至此可在RGC发育过程中大致勾勒出Math5决定早期RPC向RGC方向分化，而Brn3b控制RGC正常发育至成熟的Math5-Brn3b调控通路。

3 bHLH转录因子对视网膜无长突细胞分化发育的调控作用

视网膜无长突细胞分布于视网膜内核层(inner nuclear layer，INL)中，是视网膜重要的中间神经元，根据其形态、功能和神经递质的不同可进一步分为众多不同的细胞亚型。虽然无长突细胞及其亚型是如何由RPC分化而来目前尚未明确，但Hatakeyama等[24]和 Inoue等[25]研究发现在无长突细胞生成早期，bHLH转录因子Math3和NeuroD在RPC中存在表达，当Math3和NeuroD同时缺失时将造成无长突细胞数量显著减少，说明Math3和NeuroD的正常表达对RPC分化为无长突细胞尤为关键。虽然Math3和NeuroD的异位表达并不能促使无长突细胞数量增加，但Math3和NeuroD与同源盒基因Pax6同时异位表达时能有效地促进无长突细胞的产生，说明bHLH转录因子与同源盒基因共同参与构成了无长突细胞的分化调控网络。在进一步关于无长突细胞亚型的分化研究中，Feng等[26]发现，bHLH转录因子bHLHb5是γ-氨基丁酸能无长突细胞正常分化的必要因素;Mo等[27]发现Barhl2的表达能有效的促进甘氨酸能无长突细胞的产生;而Cherry等[28]发现NeuroD2表达于AII无长突细胞中，并对AII无长突细胞的数量和轴突生长起着重要调控作用。说明bHLH转录因子是视网膜无长突细胞及其亚型细胞命运选择过程中的重要调控因素。

4 bHLH转录因子对视网膜双极细胞分化发育的调控作用

视网膜双极细胞与无长突细胞作为视网膜重要的中间神经元，是连接感光细胞和RGC的纽带，进行着视觉信息的视网膜内传递。在双极细胞的分化发育研究中Hatakeyama等[24]发现bHLH转录因子Mash1和Math3结合同源盒基因Chx10共同调控着双极细胞的分化过程，其中Mash1和Math3的表达决定产生双极细胞的数量，而Chx10的表达则使双极细胞在INL中形成固定的排列，并且Mash1、Math3和Chx10的同时异位表达能有效地促进双极细胞的生成。可见与无长突细胞的分化过程相似，双极细胞的分化过程也同样受到bHLH转录因子和同源盒基因的共同调控。进一步研究发现视网膜双极细胞根据其所在视觉传导通路的不同而分为不同细胞亚型，Feng 等[26]和 Bramblett等[29]分别发现 bHLH 转录因子bHLHb5和bHLHb4分别表达于视锥双极细胞和视杆双极细胞亚型中，是这两种双极细胞亚型分化和发育的重要调控因素，对这两种双极细胞亚型的存活和功能维持起着关键作用。说明bHLH转录因子在视网膜双极细胞及其亚型的分化选择及发育成熟过程中具有重要地位。

5 bHLH转录因子对视网膜水平细胞和感光细胞分化发育的调控作用

利用基因敲除技术的研究发现在视网膜水平细胞和感光细胞的分化发育过程中，由多种bHLH转录因子组成的调控网络发挥着重要的作用，其中Akagi等[30]研究发现 Ngn2、Math3和 NeuroD 的缺失将造成视网膜水平细胞的大量减少;而Mash1、Ngn2和Math3的缺失在造成视网膜水平细胞显著减少的同时伴有RGC的明显增加;当Mash1、Math3和NeuroD被敲除时将造成视网膜感光细胞数量的明显减少;且Conte等[31]发现NeuroD和同源盒基因Pax6相互作用，控制着感光细胞和无长突细胞间的命运选择及分化后的正常发育过程。说明bHLH转录因子的表达对RPC分化时的视网膜水平细胞和感光细胞命运选择具有重要的调控作用。同时上述研究中还发现在bHLH转录因子表达缺失的情况下均伴有Müller胶质细胞的明显增加，说明bHLH转录因子是RPC向神经元细胞或Müller胶质细胞分化方向选择过程中的关键决定因素。因此一个由多种bHLH转录因子成员间相互作用，相互影响并结合同源盒基因所组成的调控网络控制着视网膜水平细胞和感光细胞的分化、发育及存活过程。

综上所述，视网膜神经细胞的发育过程受到多种因素的影响，其中bHLH转录因子是细胞分化、命运选择和胶质细胞产生的关键调控因子。从早期RPC增殖与分化的数量平衡控制，到RPC分化时的细胞命运选择，以及在视网膜神经细胞分化完成后维持RPC未分化状态而生成Müller胶质细胞的整个过程中bHLH转录因子均发挥着重要的作用。目前眼科临床工作中对于如年龄相关性黄斑变性、青光眼和视网膜色素变性等视网膜神经细胞变性性疾病，只能通过治疗来预防或延缓病情的发展，但无法恢复已损伤的视网膜神经细胞数量。基因治疗、干细胞移植和视网膜移植已成为此类疾病治疗中新的研究热点，随着对视网膜转录因子调控功能的深入研究和干细胞培养技术的发展，Ong等[32]认为通过在多能干细胞(如RPC)中引入分化调控转录因子而诱导其定向分化成所需的神经细胞类型已成为可能。目前Haruta等[33]已成功在由虹膜提取的神经干细胞中引入特定转录因子而诱导出视网膜感光细胞;Ooto等[34]在具有神经干细胞特性的Müller胶质细胞中表达特定转录因子而成功诱导出视网膜神经元细胞。Nakano等[35]通过转录因子介导的人类胚胎干细胞定向诱导培养出了人类视网膜组织，得到的视网膜与由小鼠胚胎干细胞培养得到的视网膜相比更接近人类视网膜结构，具有完整的视盘和明显的层次排列，且视网膜中同时具有视锥和视杆两种感光细胞，具有成为临床视网膜移植供体的潜力。总之，针对视网膜转录因子调控网络研究的不断深入和完善，将为视网膜变性性疾病中的神经细胞再生难题提供新的基因治疗手段;同时以此为基础的人类胚胎干细胞定向分化研究将有可能获得可用于临床的新型视网膜组织材料，为视网膜疾病的治疗提供新的途径。

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