MicroRNA在肿瘤中的研究进展

任 俊(综述)，汤黎明(审校)

(南京医科大学附属常州第二人民医院普外科，江苏常州213003)

MicroRNA(miRNA)包含19～24个核苷酸的非编码小分子RNA，于1993年首次由Lee等［1］在研究漂亮新小杆线虫的发育时发现的，lin-4基因虽不编码蛋白质，但其能够转录形成含有22个核苷酸的片段，而这一片段能够与lin-14 mRNA的3'端非翻译区通过碱基互补配对的方式结合，从而抑制其翻译。起初这一新颖的基因调节方式并未被人们所重视。2000年，Reinhart等［2］在线虫中发现了另外一个和其发育相关的时间相关性基因let-7，同年在人类、果蝇等动物中相继发现了let-7的同源基因，这些基因在各自的生物发育过程中也起着重要的调节作用。2001年三个实验室的研究人员在Science杂志先后报道了从线虫、果蝇以及人类中克隆出了几十个类似 lin-4、let-7 的小分子 RNA，统称为“miRNA”［3-6］。随后这一类小分子RNA引起了全世界学者的关注，现就miRNA在肿瘤中的最新研究进展予以综述。

1 miRNA概述

随着越来越多的miRNA在众多物种间的发现，2003年由全世界知名miRNA研究机构联合制订了不同物种中新发现的miRNA命名及注释准则［7］。该准则包含表达标准和生物起源准则两个方面。表达标准:①在标本中通过原位杂交技术检测到独特的22碱基的RNA转录物。②这一RNA的序列必需由切割RNA相应的cDNA库所鉴定。生物起源准则:①候选miRNA的前体必须含有22个碱基成熟miRNA序列构成的发夹结构。②候选miRNA及其前体发夹结构在生物体中必需有系统发育的保守性。③Dicer酶是候选miRNA前体产生所必需的，通常在Dicer酶活性降低的生物体中均有miRNA前体的过度积累。这一准则降低了不同研究机构间miRNA定义的偏差，有利于研究的开展。目前，这一准则也有所变化，如miRNA产生的Dicer酶及进化保守需求已不再作为筛选条件。

2 miRNA的产生及作用机制

miRNA的产生先后经历了核内、胞质加工阶段，其初始转录物(pri-miRNA)在细胞核内的RNA聚合酶Ⅱ的作用下产生。随后在DROSHA酶的作用下剪切成含有60～75个核苷酸的前体RNA(pre-miRNA)，接着在核表面的转运蛋白exportin5的作用下被转运到细胞质，并在Dicer酶的作用下剪切成为含有19～24个碱基长度的双链miRNA。随后双链打开，其中一条链通常与靶mRNA的3'-非翻译区(UTR)结合形成“RNA诱导的沉默复合体”，进而导致该mRNA的裂解或翻译阻断，与其互补的另一条单链则被降解［6-7］。miRNA导致靶mRNA裂解或翻译阻断的两种不同结果取决于miRNA的“种子序列”(5'端第2～8个碱基)与mRNA3'-UTR碱基的互补配对程度，匹配度高时导致该mRNA降解，匹配度低时则只能导致其翻译阻断。每一个miRNA都有成百上千的作用靶点，其与蛋白质调节因子不同，能在较高层次调节多种生物学功能，且miRNA在物种间具有较高的保守性、时序性以及组织特异性，提示miRNA可能参与决定细胞、组织的功能特异性。

3 miRNA的研究方法

3.1 miRNA表达的检测 目前研究miRNA表达水平的方法主要有测序、miRNA芯片以及实时荧光定量PCR。微阵列技术也称生物芯片或者基因芯片技术，其特点是高通量，能在较短时间内分析样本间miRNA表达的倍数变化［8］。RT-PCR的方法虽然检测效率较低，但因其简便、快速，因此在实际研究中也得到了广泛应用，但miRNA长度很短，用传统的PCR方法检测很容易导致非特异性扩增。2005年，Chen等［9］报道的茎环引物RT-PCR法很好的解决了这一难题，设计好的茎环状引物5'端以6个碱基与目的miRNA分子的3'端互补结合，在反转录酶的作用下转录形成茎环结构的cDNA，以其为模板可进行传统的荧光定量PCR。这一方法不仅增强了PCR的特异性还提高了效率。原位杂交技术目前也广泛用于miRNA的研究，其优势在于可以对miRNA在细胞或组织中的表达进行定位，但提供的定量信息较少。以上方法主要关注miRNA的表达与定量，并仅局限于研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的miRNA，无法发现和寻找新的miRNA。而近年兴起的miRNA测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性，使研究人员能够直接对样本中指定大小的所有miRNA分子进行高通量测序，在无需任何序列信息的前体下研究miRNA的表达谱并在此基础上发现和鉴定新的miRNA分子，这是传统的研究方法所无法比拟的。

3.2 miRNA靶基因的寻找 随着越来越多的miRNA被发现，寻找这些miRNA的作用靶点以明确它们在细胞中的作用机制一直是研究的重点。目前常用的生物信息学预测方法是根据miRNA与mRNA3'-UTR结合的序列及热力学特点而衍生出的，其中由Bartel［7］研究小组建立的Target Scan软件是目前使用最为广泛的miRNA靶基因预测软件，其他较为常用的有miRanda、PicTar、RNAhybrid、DIANA-microT 等。对于生物信息学方法预测的靶标基因，需再借助荧光素酶报告基因系统、miRNA获得或缺失性实验进一步确认。

4 miRNA在肿瘤中的研究

传统的观点认为肿瘤的发生是由编码蛋白的基因或者抑癌基因功能变化所致。而近年来众多研究表明这一类非编码小分子RNA也就是miRNA在肿瘤中也起着与蛋白编码基因类似的功能，它们参与了一些与肿瘤发生相关的重要细胞的生物学过程［10］。

4.1 常见的抑癌miRNA及其作用机制 最早关于miRNA与肿瘤的研究是2002年由Calin等［11］提出的，研究显示位于非编码基因DLEU2内含子区域的miR-15a、miR-16-1在绝大多数慢性淋巴细胞白血病患者中表达下调或者完全缺失，提示miR-15a、miR-16-1的表达在维持B淋巴细胞稳态中起着不可或缺的作用。随后，Cimmino等［12］研究发现这两种miRNA能够下调原癌基因Bcl-2的表达，从而增加B细胞的凋亡，抑制其增殖，明确了其在慢性淋巴细胞白血病中的抑癌基因角色。Fabbri等［13］更深层次地揭露了miR-15a、miR-16-1基因簇在慢性淋巴细胞白血病中的作用机制，研究显示miR-15a、miR-16-1基因簇的缺失不仅活化了抗凋亡基因Bcl-2的表达，而且也上调了抑癌因子TP53的表达，因此在一定程度上减缓了肿瘤生长。TP53的表达上调活化了miR-34b/c，从而降低了ZAP70的表达，但之前有报道ZAP70低表达的慢性淋巴细胞白血病患者从诊断到必须治疗的时间明显高于对照组［14］，进一步肯定了miR-15a、miR-16-1基因簇缺失患者肿瘤成惰性生长的说法。miR-15a、miR-16-1的抑癌效应不仅在于对原癌基因Bcl-2的下调作用，还有报道其与miR-34协同诱导非小细胞肺癌细胞阻滞在G1～G0期［15］;miR-34家族三个成员miR-34a/b/c均受抑癌基因p53调控转录。Cole等［16］研究显示，miR-34a通过抑制 MYCN 的表达可抑制神经母细胞瘤的生长。let-7家族成员位于与多种肿瘤(如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌等)相关的脆性位点，有研究表明let-7a在肺癌组织中低表达与肺癌患者术后低生存期呈正相关，而且过表达之后能够显著抑制肺癌细胞的克隆形成能力［17］。最新研究表明，let-7b在非小细胞肺癌病患者血浆中的表达，也低于正常水平，并且其低表达与肿瘤恶性程度呈正比，为肺癌患者的预后判断提供了新思路［18］。上皮间质转化起初被认为与胚胎发育有关，近年来研究表明上皮间质转化还参与肿瘤的形成及转移过程［19］。miR-200/141家族属于上皮特异性的miRNA，大量研究表明这一家族成员通过抑制E-钙粘连蛋白转录抑制子ZEB1、ZEB2的表达，从而抑制上皮间质转化的过程［20］，miR-200/141依靠这一主要机制以及其他机制抑制了多种肿瘤的生长、转移等恶性生物学行为，如膀胱癌［21］、乳腺癌［22］、肺癌等［23］。

4.2 常见的致癌miRNA及其作用机制 miR-17-92基因簇位于13q31，He等［24］采用特定的微阵列技术检测出65%的B细胞淋巴瘤样本中miR-17-92多顺反子表达上调，随后为了验证这一上调的多顺反子能够导致肿瘤形成，在转MYC基因诱导的B细胞淋巴瘤模型小鼠中通过反转录病毒的方法过表达造血干细胞中的miR-17-92后，miR-17-92协同MYC加速了肿瘤的形成，提示其抑癌基因的功能。越来越多的证据表明，miR-17-92 在大肠癌［25］、多发性骨髓瘤［26］、肺癌［27］、乳腺癌［28］等肿瘤中均起着抑癌基因的功能。早期已有实验证明miR-21能够抑制凋亡而促进肿瘤生长，Chan等［29］在恶性胶质瘤中敲低miR-21后，可激活细胞凋亡 caspases途径。Hatley等［30］进一步研究表明，miR-21可不仅通过抑制程序性细胞死亡因子4这一凋亡因子的表达，也可通过下调SPRY2进而激活原癌基因Ras下游的MEK/ERK，最终引起miR-21自身转录从而抑制凋亡，促进增殖。miR-155由BIC基因编码，是最早发现的致癌miRNA之一，最初发现其在儿童Burkitt's(伯基特)淋巴瘤中表达上调，目前众多研究表明其在霍奇金病、慢性淋巴细胞白血病［31］、急性髓性白血病［32］、肺癌、乳腺癌［33］以及胰腺癌［34］等肿瘤中均高表达，且起着致癌基因的作用。机制研究表明，miR-155通过下调Ship和c/EBPβ的表达导致一系列连锁反应，最终导致前B细胞的蓄积以及急性成淋巴细胞性白血病的形成［35］。miR-221/222也是较为常见的致癌miRNA之一，其表达上调与多种肿瘤细胞的增殖［36］、凋亡［37］、侵袭能力有关。Garofalo 等［38］报道肝细胞生长因子受体可通过转录活化c-Jun而上调miR-221/222的表达，上调的miR-221/222通过作用于PTEN、TIMP3而拮抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体引起的凋亡，并且能够增强肺癌、肝癌细胞的恶性生物学特性。Pineau等［39］在人体肝癌组织标本以及肝癌细胞系中的实验进一步证实了以上观点，还发现miR-221/222通过下调细胞周期依赖性激酶抑制子p27Kip1的表达而增强肝癌细胞的增殖能力。

4.3 miRNA与肿瘤诊断 miRNA的表达谱与肿瘤的胚胎起源密切相关，并且其表达呈现组织特异性，因此，miRNA可以作为有效的肿瘤诊断标志物。近年越来越多的证据表明循环中的miRNA可作为无创的、敏感的肿瘤诊断标志物。Heneghan等［40］研究表明乳腺癌患者血液循环中miR-195的表达水平与肿瘤大小、分期有关，并且在肿瘤切除术后2周能够恢复到正常水平，而其表达水平在其他(如前列腺、结肠、肾脏等)肿瘤患者血液中并没有升高。Ng等［41］最新研究显示，miR-17-92基因簇中的 miR-17-3p、miR-92在结直肠癌患者血浆中表达水平明显升高，可作为肿瘤早期诊断指标，并且这两个指标还可以用来区分炎症性肠疾病、胃癌以及正常人群。Yanaihara等［42］筛选出 12 种 miRNA(miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212、miR-214)，可以用来诊断非小细胞肺癌。Rabinowits等［43］在临床病例中进一步对这12种miRNA进行研究，发现miRNA的表达谱可以精确地区分肺癌患者和正常人群，可以作为肺癌早期大规模筛查的有效手段。

4.4 miRNA与肿瘤治疗 miRNA在肿瘤中异常表达，而功能研究表明miRNA通过转录后调节机制影响基因的表达从而起着致癌或者抑癌基因的功能，因此miRNA以及其靶基因可以作为有效的药物作用靶点。目前最有潜力的治疗手段是miRNA类似物(miRNA mimic)以及反miRNA寡聚核苷酸类。近年来有研究表明，在小鼠或者灵长类动物中通过全身给予反miR-122的寡聚核苷酸类可以改变肝脏脂类代谢以及减少乙型肝炎病毒的复制，从而减轻肝脏损伤，并且无明显不良反应［44-45］。miR-26a在肝细胞癌中呈低表达，并且在多种肿瘤中发挥着抑癌基因的功能，Kota等［46］通过腺病毒感染给肝癌模型小鼠全身给予miR-26a后发现减小了肿瘤体积。随着研究的深入，miRNA可能成为肿瘤治疗新手段。

5 问题与展望

miRNA的研究对于揭示肿瘤的发病机制意义重大，目前miRNA已成为肿瘤研究领域中的热点，越来越多的miRNA被发现在肿瘤中表达失调，并且其与肿瘤发生、发展的机制也逐渐明晰。目前有关miRNA的研究虽已取得较大进步，但仍存在很多问题:①大量的miRNA尚未被发现，其作用机制尚未被揭示。②鉴于miRNA作用靶点众多，不同的miRNA可作用于相同的靶点，因此完整揭示miRNA的调控网络显得较为困难。③血液循环中的miRNA可作为肿瘤患者的诊断指标，但这些miRNA是如何进入循环，循环中的miRNA是否在疾病发展中存在作用?如何安全、有效、靶点特异性地使用miRNA类似物或者反miRNA寡聚核苷酸类治疗肿瘤仍需进一步研究。随着这些问题的解决，miRNA必将为人类抗肿瘤治疗注入新的活力。

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