头孢泊肟酯片微生物限度检查方法的建立

范震洪，黄佳

首都医科大学附属北京天坛医院药剂科，北京 100050

头孢泊肟酯片为口服第三代头孢菌素类药物，具有广谱、杀菌力强等特点[1]。为保证临床应用的安全性，目前各国药典不仅对注射用药品规定必须进行无菌检查，而且对口服制剂的微生物污染状况也有明确的质控指标[2-6]。在对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查时，应首先消除其抗菌活性，并通过实验验证抗菌活性去除的是否彻底，以保证检验结果的有效性[7]。薄膜过滤法是去除药品中抗菌成分的最有效方法。但由于头孢泊肟酯片具有较强的抗菌活性，使得无法简单采用水溶液作为冲洗剂去除抗菌成分。大量的冲洗，不仅影响滤膜的孔径，使截留在膜上的细菌滤过，而且还使污染的细菌受到损伤，从而降低阳性检出率，影响实验结果的准确性。我们在实验中发现，利用β-内酰胺酶能使β-内酰胺类抗生素失去抗菌活性的特点[8-13]，在培养基中加入β-内酰胺酶作为中和剂，可有效地去除头孢泊肟酯片的抑菌作用，据此，建立了头孢泊肟酯片微生物限度检查法；并对实验中的标准操作(SOP)方法进行了探讨。

1 仪器与材料

WJ-6无菌检查仪(天津市罗根科技有限公司)，800型离心机(上海手术器械十厂)，YJA型匀浆仪(台州市椒江五星机械仪器有限公司)，一次性薄膜过滤器(规格：NS01-75D2，批号：201100209；孔径：0.45μm；材质：尼龙膜)，生化培养箱(德国Binder公司)。头孢泊肟酯片(50mg/片)：海南海灵制药厂。

培养基为胆盐乳糖增菌液、玫瑰红钠琼脂、营养琼脂、营养肉汤、改良马丁、改良马丁琼脂(批号分别为01104192、0110828、0110314、0110808、0110902、0110520，北京三药科技开发有限公司，灵敏度实验符合《中华人民共和国药典》2010规定[2]附录107-113)。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC-B63501]、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC-B 26003]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC-B 44102]、白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC-F 98001](中国医学细菌保藏中心)，黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC-F 98003](中国药品生物制品检定所)。

β-内酰胺酶：300万单位/mL(中国药品生物制品检定所)。

2 方法

参照2010年版《中华人民共和国药典》二部微生物限度检查法[2]附录107-113实验，简述如下。

2.1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h。上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu[2]附录107-113的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养5～7d，加入3～5mL 0.9%的无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液[2]附录94。

2.2 供试液制备 称样品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100mL至无菌的匀浆罐中，匀浆2 min(3000r/min)，制成质量浓度为100g/L的供试液，将此供试液离心5min(500r/min)，取上清液备用。

2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数检查验证试验

2.3.1 平皿法 取质量浓度为100g/L的供试液1mL入1个平皿，加入验证菌，然后每皿加约20mL营养琼脂作细菌计数；玫瑰红钠琼脂作霉菌和酵母菌计数，摇匀、培养、观察结果。

2.3.2 薄膜过滤法 取供试品的上清液1mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀释至100mL，全量通过薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液冲洗薄膜2次，每次100mL，在最后一次的冲洗液中，加入验证菌，滤过后，将薄膜贴至含2mLβ-内酰胺酶的营养琼脂培养基平板上，37℃培养，观察结果。

2.4 控制菌检查验证实验 取供试品的上清液10mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀释至100mL，全量通过薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液冲洗薄膜2次，每次100mL，将薄膜加至含2mLβ-内酰胺酶的100mL胆盐乳糖增菌液后，再加入菌数为50～100cfu的大肠埃希菌悬液，30～35℃培养24～48h，观察结果。

3 结果与讨论

3.1 微生物限度检查法的建立 由于头孢泊肟酯片具有较强的抗菌活性，但对霉菌和酵母菌基本无抗菌活性[1]，为快速建立有效的微生物限度检查方法，我们采用薄膜过滤法结合在培养基中加入中和剂的方法，进行细菌计数检查和控制菌检查，采用平皿法进行霉菌和酵母菌计数检查；结合2010年版中国药典中规定的常用验证菌株[2]，选择枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26003]为细菌的代表菌株，白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F) 98001]为霉菌和酵母菌的代表，分别进行薄膜过滤法和平皿法实验条件的筛选；进行实验条件筛选的菌株称为筛选菌株[8-13]。

采用平皿法检查头孢泊肟酯片时，样品经1:200稀释后对筛选菌株白色念珠菌的回收率平均为94%，在此条件下，用黑曲霉进一步验证，其回收率也平均为97%。说明常规的平皿法(1:200)，即可满足头孢泊肟酯片霉菌和酵母菌计数检查的需要。

采用薄膜过滤法结合在培养基中加入中和剂的方法，去除头孢泊肟酯片的抗细菌活性，当冲洗量为300mL时，枯草芽孢杆菌的回收率平均为85%，而金黄色葡萄球菌的回收率平均为91%(表1)，提示头孢泊肟酯片对枯草芽孢杆菌较金黄色葡萄球菌更敏感，故仅采用枯草芽孢杆菌作为筛选菌株即可满足实验条件筛选的需要(表1)，证明了方法的有效性。

结合细菌计数检查的验证试验结果，进行控制菌检查的验证实验。当采用薄膜过滤法结合在培养基中加入中和剂的方法，且总冲洗量为300mL(100mL/次)时，已能满足控制菌检查的基本要求。

验证试验中筛选菌株的意义在于明确指征药品的抑菌成分是否被消除，如筛选菌株生长良好，则说明供试品在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，可以照此检验条件进行进一步的验证；如其它阳性菌在此条件下生长微弱、缓慢或不生长者，则说明该检验条件未能完全去除该药物的抑菌作用，应对检验条件进一步调整以达到完全去除供试品抑菌成分的目的。因此筛选菌株选择的正确与否是能否实现快速建立抗菌药物微生物限度检查方法的关键。

3.2 实验操作对结果的影响

3.2.1中和剂对实验结果的影响 由于头孢泊肟酯片具有较强的抗菌活性，单纯采用薄膜过滤法，不能去除头孢泊肟酯片的抗菌活性，β-内酰胺酶(β-lactamase)作为中和剂，在β-内酰胺环上的羰基碳上结合β-内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物，从而重建了β-内酰胺酶，或是与头孢泊肟酯片的羰基碳的酰胺键相互作用，使头孢泊肟酯片失活[14,15]。故确定β-内酰胺酶作为中和剂。对中和剂的加入量进行选择，发现中和剂的加入量过小，不能完全消除药物的抗菌活性；中和剂加入量过大，会造成不必要的浪费，容易污染[9]。以2mLβ-内酰胺酶作为中和剂，可满足实验的需要。

3.2.2 培养基和冲洗液的温度对实验结果的影响 由于β-内酰胺酶在55℃时活性较高[16]，所以制备含β-内酰胺酶平板时，培养基的温度应控制55±5℃之间。进行薄膜过滤时，如冲洗液的温度较低，药物及其辅料不能充分溶解，易堵塞薄膜；适当提高冲洗液的温度至45℃时，可以增加供试液的滤过性，降低头孢泊肟酯片在薄膜上的吸附；但冲洗液的温度大于45℃，容易伤害药品中污染的杂菌，影响检验结果。

3.3头孢泊肟酯片微生物限度检查法操作的SOP 称样品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100mL至无菌的匀浆罐中，匀浆2min(3000r/min)，制成质量浓度为100g/L的供试液，将此供试液离心5 min(500r/min)，取上清液备用。

取1:10的供试液，采用平皿法1mL/皿，测定霉菌和酵母菌数。

取供试品的上清液1mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀释至100mL，全量通过薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液冲洗薄膜2次，每次100mL，将薄膜贴至含2mLβ-内酰胺酶的营养琼脂培养基平板上，测定细菌数。

取供试品的上清液10mL，用0.1%蛋白胨水(45℃)稀释至100mL，全量通过薄膜后，再用0.1%的蛋白胨水(45℃)溶液冲洗薄膜2次，每次100mL，将薄膜加至含2mLβ-内酰胺酶的100mL胆盐乳糖增菌液中，测定控制菌。

3.4 对头孢泊肟酯片微生物限度检查法验证工作的思考 由于β-内酰胺类抗生素具有相似的抗菌活性，因此，对本文未涉及的β-内酰胺类抗生素，如头孢唑啉、替卡西林等[17,18]，可以根据相应药物的原始实验验证数据，直接选用其敏感菌株，例如枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌进行实验条件的筛选。选择实验条件时，最重要的是确定中和剂的最佳加入量，使其既可以完全消除药物的抗菌活性，又不会由于过量出现污染和浪费。

通常，当药品生产条件发生改变(如更换产地、更换辅料、改变生产工艺等)或检测条件发生改变(改换检测实验室等)时，对微生物限度检查方法应进行再验证。由于进行再验证时，药品中的活性成分未发生改变，故其抗菌谱也未改变，因此我们认为再验证工作仅需针对药典规定的全部验证菌株中的最敏感菌株即可，而不必对全部菌株再进行验证。即对头孢泊肟酯片进行再验证时，仅需证明实验中最敏感菌株(枯草芽孢杆菌)的回收率大于70%，即可说明检查方法有效，而无需再逐一验证大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率。采用这种方法，即可保证检验方法的有效性，又节省了大量人力、物力，使得验证工作成为日常检验的一部分成为可能。建议药典逐渐收载各抗菌药物的最敏感验证菌株作为质控菌株，方便日常工作。

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