新银合欢中单宁提取工艺优化研究

李 茂，字学娟,3，周汉林， 刘国道

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737； 2.中国热带农业科学院热带草业与畜牧研究所，海南 儋州 571737； 3.海南大学应用科技学院(儋州校区)，海南 儋州 571737)

后生物生产层

新银合欢中单宁提取工艺优化研究

李 茂1,2，字学娟1,2,3，周汉林1,2， 刘国道1,2

(1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737； 2.中国热带农业科学院热带草业与畜牧研究所，海南 儋州 571737； 3.海南大学应用科技学院(儋州校区)，海南 儋州 571737)

对新银合欢(Leucaenaleucocephala)中单宁类物质的提取工艺进行优化研究，选择液料比、提取温度、提取时间、提取剂体积分数等因素分别进行单因素和正交试验。结果表明，在液料比40∶1、提取温度50 ℃、提取时间60 min、丙酮体积分数50%的条件下，单宁提取效果最佳，测得新银合欢单宁平均含量为2.54%。

新银合欢；单宁；提取

新银合欢(Leucaenaleucocephala)为豆科含羞草亚科银合欢属多年生灌木或乔木，是我国一种重要的木本豆科饲用植物[1]。新银合欢叶片干物质中粗蛋白质含量为22%～29%，被联合国粮农组织的饲料专家誉为干旱地区的“蛋白质仓库”；且氨基酸、胡萝卜素、多种维生素和微量元素含量丰富，是联合国粮农组织向亚太地区推广的多用途优良树种之一[1]。1961年8月华南热带作物科学研究院(现中国热带农业科学院)从中美洲引进少量萨尔瓦多型银合欢种子，1962年开始试种观察，繁殖种子[2]。

单宁(Vegetable tannin)是指存在于植物体内的多元酚类物质，并可与蛋白质、生物碱和多糖等化合物发生反应，是一种保护性物质[3-4]。在畜牧业生产中，单宁一般被当作饲料的抗营养因子，特别在热带亚热带木本饲用植物中含量较高，影响动物的采食和消化。国内许多学者已经从紫花苜蓿(Medicagosativa)、槟榔果(Arecacatechu)、红豆草(Onobrychisviciaefolia)、山蚂蝗属(Desmodium)、决明(Cassianictitoms)等植物中提取单宁或进行相关研究[5-9]，而新银合欢的研究主要集中在其栽培技术、营养价值和含羞草素上[10-13]，对其单宁的提取研究较少。本研究建立了新银合欢中单宁的优化提取工艺，为科学利用新银合欢资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料 供试所用新银合欢(开花期)新鲜嫩茎叶，采集于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所实验基地(海南省儋州市)。样品经杀青后烘干、过80目筛粉碎备用。

1.1.2试剂 单宁酸(C76H52O46)、磷钼酸、钨酸钠、磷酸、无水碳酸钠、无水乙醇、丙酮、甲醇。

Folin-Denis 显色剂：10 g磷钼酸，50 g钨酸钠溶于750 mL 蒸馏水中，再加入50 mL 85%的磷酸，煮沸后回流2 h，冷却定容至 1 000 mL，保存于棕色瓶中。

饱和 Na2CO3溶液：35 g 无水Na2CO3加热溶解于100 mL水中，冷却晶体后用快速滤纸过滤，溶液备用。

1.1.3仪器 723PCS可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)和CHZ-82A 恒温振荡器(金坛市富华仪器有限公司)。

1.2方法 标准曲线绘制及单宁提取方法参照字学娟[14]的方法。

1.2.1提取剂的选择 选用蒸馏水、50%(V/V)丙酮、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液，按液料比为50∶1、40 ℃、40 min的条件分别进行提取，测定单宁的含量。

1.2.2单因素试验 选择丙酮体积分数、浸提时间、浸提温度和液料比进行单因素试验。丙酮体积分数分别设置为20%、30%、40%、50%、60%、70%；浸提时间为20、30、40、50、60和70 min；浸提温度分别设置为室温(约20 ℃)、30、40、50、60和70 ℃；液料比分别设置为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1。

1.2.3正交试验 为了验证各单因素间的相互作用效果,选用对单宁提取影响较大的提取剂体积分数、料液比、提取时间、提取温度4个因素进行4因素3水平L9(34)正交试验,确定提取新银合欢中单宁的最佳工艺参数。

1.2.4回收、重复性试验 称取银合欢20份各1 g，按正交试验结果中最佳工艺制备浸提液，其中10份样品浸提液中加入不等量的单宁，对加入单宁的量进行回收试验。回收率=(加单宁后测得单宁含量-未加单宁测得单宁含量)/加入单宁含量×100%。根据两种处理试验结果进行重复性比较。

1.2.5数据处理 采用SAS软件和Excel软件进行数据处理和统计分析，方差分析(ANOVA)过程中均值的多重比较采用Duncan法进行。

2 结果与分析

2.1提取条件对单宁提取的影响性

2.1.1提取溶剂对新银合欢中单宁提取的影响 选用去离子水、50%(V/V)丙酮、50%甲醇溶液、50%乙醇溶液，按液料比为50∶1、40 ℃、40 min的条件进行提取，测定单宁的含量(图1)。

图1 不同提取溶剂对新银合欢中单宁的提取量Fig.1 Effects of extraction solvent on tanninextraction from Leucaena leucocephala

丙酮溶液提取效果最好，甲醇和乙醇提取单宁含量相近，去离子水提取效果最差。甲醇是有毒试剂，使用时易造成安全隐患。在使用乙醇溶液提取的过程中发现，浸提溶液较混浊，过滤十分困难，不利于后续处理。所以选择对单宁溶解性好、提取率高的丙酮溶液作为提取剂。

2.1.2提取溶剂体积分数对新银合欢中单宁提取的影响 分别用20%、30%、40%、50%、60%、70%丙酮溶液提取，提取温度40 ℃，液料比为50∶1，提取40 min，过滤、定容,测定单宁含量(图2)。

图2 提取溶剂浓度对新银合欢中单宁提取的影响Fig.2 Effects of acetone concentration on tannin extraction from Leucaena leucocephala

40%丙酮溶液对单宁的溶解能力最强,丙酮体积分数高于或低于40%时提取率有所下降。这与丙酮的理化性质有关，加入适量的水比纯丙酮溶液对单宁的提取量要高，可显著改善单宁提取效果[15]。

2.1.3提取时间对新银合欢中单宁提取的影响 提取时间分别为20、30、40、50、60和70 min,用50%丙酮溶液、在温度40 ℃、液料比为50∶1提取、过滤、定容，测定单宁含量(图3)。

图3 提取时间对新银合欢中单宁提取的影响Fig.3 Effects of extraction time on tannin extraction from Leucaena leucocephala

随着提取时间的增加，新银合欢中单宁含量也有所增加，50 min处理单宁含量最高，而后逐渐下降)。说明经过一段时间(约50 min)的提取后样品与浸提溶液中单宁含量趋于平衡，即已达到浸提最大值。单宁是多酚类物质，丙酮具有一定的氧化性，时间过长可能使单宁部分氧化，导致单宁含量下降。

2.1.4提取温度对新银合欢中单宁提取的影响 在相同条件下(50%丙酮、40 min、50∶1液料比)，分别在室温(约20 ℃)、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取，过滤定容后，测定单宁含量(图4)。

图4 提取温度对新银合欢中单宁提取的影响Fig.4 Effects of temperature on tannin extraction from Leucaena leucocephala

随着提取温度的增加,新银合欢中单宁含量也有所增加,50 ℃时单宁含量最高，当温度继续增高时单宁含量逐渐降低。这是由于温度较低时，温度的增高促进单宁在丙酮中的溶解，提取的单宁含量逐渐增加。但是过高温度单宁易发生降解、缩合、氧化等化学反应，导致提取的单宁含量下降。另外高温会加快丙酮的挥发，增加了成本。

2.1.5液料比对新银合欢中单宁提取的影响 在相同条件下(50%丙酮、40 min、40 ℃)，分别在液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1和70∶1下提取，过滤定容后，测定单宁含量，得单宁含量与液料比的关系(图5)。

图5 液料比对新银合欢中单宁提取的影响Fig. 5 Effects of liquid-material ratio on tannin extraction from Leucaena leucocephala

随着液料比的增加,新银合欢中单宁含量也有所增加,液料比为50∶1时单宁含量最高(略高于液料比40∶1的单宁含量)，当液料比大于50∶1时，单宁含量逐渐减少。可能是由于液料比过低时样品与提取液搅拌不均匀，影响了单宁的提取；而液料比过高(即丙酮溶液较多)则增加了单宁的氧化机会，也可能造成提取的单宁含量低。

2.2新银合欢中单宁提取的正交试验 通过单因素试验确定了单宁提取率的主要影响因素为丙酮体积分数、提取时间、提取温度和液料比，进行正交试验探讨提取的最佳工艺条件，试验因素和水平见表1。

极差分析可知，4个因素的极差大小为Dgt;Cgt;Bgt;A(表2)，液料比对单宁的提取影响最大，提取时间的影响较小。通过极差分析最优组合为A3B3C2D1，即液料比为40∶1、温度为50 ℃、提取时间为60 min、丙酮浓度为50%，此时提取的单宁为2.566 1%。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 单宁回收和重复性测定结果Table 3 Measurement of tannin recycling and reproducibility

2.3新银合欢中单宁提取最优组合的重复性和回收分析 通过最优组合测得单宁含量平均值为2.54%，标准差为0.03，表明该方法重复性较高；单宁回收率在0.93～1.13，标准差为0.06，回收率较高。

3 讨论与结论

单宁类化合物多采用有机溶剂或水提取，但各有优缺点，纯有机溶剂提取单宁，可能导致组分不完全[16]；而水的极性较大，溶液杂质多，不利于下一步分离，故一般很少单独使用有机溶剂或水。前人研究[17]结果表明，单宁在有机溶剂的水溶液中溶解度更大，例如丙酮、乙醇、甲醇等的水溶液。本试验中使用甲醇、乙醇、丙酮水溶液提取单宁，发现甲醇、乙醇提取单宁的量相当，丙酮水溶液提取单宁含量最高。由于甲醇为有毒试剂，乙醇为易燃易爆化学品，应用前景受限。而丙酮水溶液对单宁的溶解能力很强，能打开单宁―蛋白质的连接键，使单宁的提取率提高[18]，综合各方面因素考虑，最终选用丙酮作为提取剂。

由单因素试验和正交试验结果，新银合欢中单宁的最佳提取条件为液料比40∶1、提取温度50 ℃、提取时间60 min、丙酮体积分数50%的单宁提取结果最佳，通过重复性和回收试验，新银合欢单宁平均含量为2.54%。

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OptimumconditionsonextractionoftanninfromLeucaenaleucocephala

LI Mao1,2, ZI Xue-juan1,2,3, ZHOU Han-lin1,2, LIU Guo-dao1,2

(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737，China; 2.Tropical Grassland and Animal Science Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China;3.College of Applied Science and Technology, Hainan University, Danzhou 571737, China)

The optimum conditions, including four main factors: ratio of liquid to material, extraction temperature, extraction time and extractant concentration, for extracting tannins from leaves and stems ofLeucaenaleucocephalawere optimized by using a combined method of single factor analysis and orthogonal experiment design. The results showed that the optimum conditions of each factor in tannin extraction were: ratio of liquid to material 40∶1, extraction temperature 50 ℃, extraction time 40 min and acetone concentration 50%. The extracting rate of the tannin from the leaves and stems ofL.leucocephalawas 2.54%.

Leucaenaleucocephala; tannins; extraction

ZHOU Han-lin E-mail:zhouhanlin8@163.com

Q946

A

1001-0629(2012)02-0301-05

2011-05-03 接受日期：2011-10-10

中央级公益科研院所基本科研业务专项(PZS066)；海南省重点科技项目(090103)；农业科技成果转化资金项目(2010GB23260578)

李茂(1984-)，男，四川绵阳人，硕士，研究实习员，主要从事热带牧草与反刍动物营养研究。

周汉林 E-mail:zhouhanlin8@163.com