非小细胞肺癌中EML4-ALK融合基因的存在状态及临床意义

天津医科大学总医院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌转移与肿瘤微环境实验室

卢雅杰 刘红雨 陈 军*

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，其中80％～85％的病例为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。据统计，在欧洲，每年肺癌新发病例超过20万，而死亡的人数占所有癌症相关死亡的20％。在美国，每年约有15万患者死于肺癌[1-3]。在中国大陆，肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势。据2008年我国卫生部的统计，肺癌相关死亡率居恶性肿瘤总死亡率的首位，为30.83/10万。在男女恶性肿瘤相关死亡中，肺癌均为最主要原因[4]。手术、放疗和化疗一直都是NSCLC的主要治疗方法。统计显示，相当一部分患者在就诊时已为ⅢB期或Ⅳ期，失去了手术治疗的机会。尽管各种新型化疗药物不断出现并为多学科综合治疗提供了新手段，以铂类为主的联合化疗方案的术后辅助化疗也已被证实可提高患者的生存期，但就晚期肺癌的治疗而言，目前在传统药物化疗方面已经到了一个平台期——以铂类为基础的化疗方案，在晚期（ⅢB or Ⅳ）NSCLC患者中，缓解率（Response Rate）仅30％～40％，中位生存期仅为8～10个月。

随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，人们越来越多地把焦点聚向了以特异性高、不良反应轻为特点的分子靶向治疗。近几年来，在肺癌的分子靶向治疗领域，研究热点集中在EGFR、K-ras和VEGF等靶点上，涌现出许多针对这些靶点的分子靶向药物。在将胞外刺激信号转导入细胞内的信号通路中一些激酶起到了至关重要的作用，分子靶向药物能够特异性地抑制这些激酶的活化，从而阻断了信号传导通路。吉非替尼（Gefitinib）商品名为易瑞沙（IRESSA），是由阿斯利康公司开发的第一个用于治疗NSCLC的分子靶向药物，是EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），其化学名为N-（3-氯-4-氟苯基）-7-甲氧基-6-（3-马啉亚丙氧基）喹唑啉-4-胺，分子式为C22H24CIFN403，为低分子量苯胺喹唑啉的衍生物，口服有活性。临床前研究显示吉非替尼本品可抑制多种类型的肿瘤细胞生长，特别是对NSCLC，其单药疗效肯定。

EGFR是由原癌基因erbB编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，属于erbB受体家族。EGFR是一种跨膜糖蛋白，它包括3个部分：胞外配体结合区域，跨膜区域和胞内部分，其中胞内部分包含有一个酪氨酸激酶区域[5,6]。EGFR广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。当表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、转化生长因子Q（transforming growth factor-Q，TGF-Q）或amphiregulin等配体与EGFR结合之后能够诱发EGFR单体之间的同二聚化或EGFR与其他erbB家族成员之间的异二聚化。EGFR二聚化使每个受体的酪氨酸激酶区域均发生磷酸化，通过磷酸化效应酪氨酸激酶区域得以活化从而触发多种信号传导的瀑布效应。在erbB受体信号传导中重要的通路包括：（1）Ras/Raf/MAPK通路，该通路通常与细胞的增殖相关；（2）PI3K/Akt通路，该通路介导多种生物学过程，包括细胞生存。

吉非替尼作为一种分子靶向治疗药物，通过抑制EGFR酪氨酸激酶胞内磷酸化阻断下游信号Akt和MAPK的传导通路，诱导细胞停止在G1期，阻止表达EGFR的肿瘤细胞的生长。但是临床实践证明并非所有患者都能从中获益，NSCLC各组织类型间存在分子靶向药物疗效上的差异。例如多项临床实验结果均证实腺癌为EGFR-TKI的优势人群。吉非替尼的抗肿瘤活性与EGFR的突变有关。Lynch[7]及Paze[8]等人研究了EGFR突变与NSCLC患者对吉非替尼的敏感性的关系，发现这些突变均发生在酪氨酸激酶区域的ATP结合位点附近，为发生在19号外显子上的缺失突变或18和21外显子上的替代突变，这两种突变改变了下游信号传导并启动了抗凋亡机制，从而产生了致癌作用。同时突变使EGFR酪氨酸激酶区域ATP结合位点周围的重要残基发生重新配置，从而稳定了这些残基与酪氨酸激酶抑制剂之间的关系，增加了肿瘤细胞对于酪氨酸激酶抑制剂的敏感性。结果表明，EGFR突变人群使用吉非替尼作为一线方案可获得更长的无进展生存期，临床研究表明，腺癌、女性、非吸烟、亚裔的NSCLC患者获益明显。这无疑是肺癌治疗史上的一个巨大的进步。

K-Ras是EGFR通路的下游信号分子，在约15％～30％的NSCLC患者中存在有K-Ras突变，该突变是一种多发生在K-Ras2号外显子第12或13密码子的点突变，发生K-Ras突变的肺腺癌细胞对于吉非替尼原发耐药并提示肿瘤预后不佳[13]。Uchida[14]等人认为K-Ras突变诱发的肿瘤对于吉非替尼的耐药性可能与该突变导致的Erk和（或）Akt活化有关。

近期在NSCLC中发现了EML4-ALK融合基因，与EGFR突变，K-ras突变往往不同时存在于一个患者体内，具有鲜明的临床特征，并且对EGFR-TKI治疗不敏感，而对ALK抑制剂敏感，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物，本文就EML4-ALK融合基因的结构及研究现状作一综述。

1 EML4-ALK融合基因的基因结构

ALK，即人类间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK），于1994年首先发现于间变性大细胞淋巴瘤AMS3细胞株中[15]，是由1 620个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于胰岛素受体家族[16]。该蛋白由膜外部分、跨膜区域以及膜内催化区域组成，下游信号通路为Ras-ERK、JAK3-STAT3，以及PI3-K/Akt等，这些通路与细胞增殖、存活、迁移密切相关[17-18]。EML4是人类棘皮动物微管相关蛋白样4（echinoderm microtubule-associated-proteinlike 4，EML4），属于棘皮动物微管相关蛋白样蛋白家族，由N末端碱基区、疏水的棘皮动物微管相关蛋白区（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein，HELP）以及WD重复区三部分构成。近年来在肺癌的研究中发现，ALK基因可通过与EML4基因形成融合基因,从而促进肺癌细胞生长，其表达产物为一种嵌合酪氨酸激酶，并且在NSCLC的发生发展中起重要的作用。

2007年Soda首次在非小细胞肺癌患者术后标本中检测到EML4-ALK融合基因。该基因是在一名62岁男性吸烟肺腺癌患者手术标本中扩增出的，由3926个碱基组成的cDNA片段，编码一个由1059个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白的氨基端（残基1-496）是EML4基因编码蛋白的一部分，而羧基端（残基497-1059）则由ALK基因编码蛋白的一部分构成[3]，重排为EML4-ALK，导致异常酪氨酸激酶表达。该融合基因定位于2号染色体的短臂上（2p21和2p23），其5’端为EML4的片段，3’端为ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接。该融合基因拥有EML4基因中的BASIC区域，疏水的棘皮动物微管相关蛋白区（hydrophobic echinoderm microtubuleassociated protein-like protein，HELP）以及部分WD重复区（后两部分在部分亚型中缺失）和ALK基因中的Kinase功能区[21]。此外，该文作者还在75名患者中发现了另外5名患者也具有EML4-ALK融合基因，这些病人EGFR 和KRAS基因均为野生型。

目前，已经报道了14种EML4-ALK融合基因的亚型，均为不同的EML4外显子与ALK基因外显子20融合而成。

2 EML4-ALK基因与NSCLC

Soda等[21]在随后的研究中，应用RT-PCR的方法对于75例NSCLC患者的组织标本进行了EML4-ALK融合基因、EGFR18、19、20、21号号外显子突变，以及K-ras突变的检测，发现5例患者存在EML4-ALK 1型融合基因（3例腺癌，2例鳞癌），同时发现该基因阳性的患者不存在EGFR以及KRAS突变。并且，在继续检测了261例包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胃肠道肿瘤在内的其他恶性肿瘤的EML4-ALK融合基因后，均未发现含有该基因。Fukuyoshi等[30]分别检测了104例肺癌、555例胃肠道肿瘤、90例乳腺癌标本，仅1例肺癌标本中发现了EML4-ALK的转录，在其余的肿瘤中均未发现该融合基因，研究者认为这样的实验结果强烈提示这一靶点很有可能为NSCLC所特有。但是2009年Lin等[31]发表在 Mol Cancer Res上的研究中，209例乳腺癌患者5例检出该融合基因，83例结直肠癌患者2例检出，106例NSCLC中有12例检出，提示该融合基因也可能与包括肺癌在内的多种实体肿瘤相关，但仍以NSCLC中检出率最高。

同年，Inamura等[25]使用RT-PCR的方法检测221例包含了腺癌、鳞癌、大细胞癌以及小细胞癌在内的肺癌患者EML4-ALK融合基因的mRNA情况，对于检测阳性的患者，进一步使用免疫组化的方法观察融合基因的表达。结果只在腺癌这一组织类型中检测到5例患者（3.4％）有融合基因的并均在细胞质中用免疫组化检测到ALK融合蛋白。

上述2项研究均来自日本，随后在1项来自欧美的多中心参与的研究中，Perner等[26]使用FISH方法检测600例NSCLC患者EML4-ALK基因情况，发现融合基因的发生率小于Soda报道的6.7％以及Kentaro 报道的3.4％，只有2.7％。并且在检测出融合基因的肿瘤中，并不是所有的肿瘤细胞均含有该融合基因。

由于早先研究淋巴瘤ALK融合基因类型的过程中，发现除了人们熟知的NPM-ALK之外还有10多种其他的融合基因，与淋巴瘤的发生发展密切相关。在NSCLC中，是否也存在除了EML4-ALK融合基因以外的其他类型的ALK融合基因，也有学者就此展开研究。Rikova等[27]的实验中，研究了41种NSCLC细胞株以及150例NSCLC肿瘤标本中磷酸化的酪氨酸相关的多个靶点，ALK相关融合基因除了3例为EML4-ALK外，还有1例为TFG-ALK融合基因。但在2008年Shinmura等[28]的研究中，使用RT-PCR以及测序检测的77例NSCLC患者，除了2例腺癌患者检测到EML4-ALK（2.6％，1型和2型各1例）外，并没有发现含有NPM、TPM3、CLTC、ATIC和TFG-ALK。

3 EML4-ALK融合基因阳性NSCLC的临床病理特征

2007年Soda首次在非小细胞肺癌患者术后标本中检测到EML4-ALK重排融合。此后，美国、日本、韩国及中国香港均有报道，但在未经选择的NSCLC中，EML4-ALK阳性检出率较低，约1.5～6.7％。为了提高该融合基因的检出率，Shaw等设定研究入组的患者必须具备两种或更多的下列特征：女性、亚裔、无或仅少量吸烟史、腺癌。结果显示141例患者中19例（13％）为EML4-ALK阳性，如果不吸烟或仅少量吸烟者/和不伴有EGFR突变者，EML4-ALK阳性率分别高达22％和33％。

美国麻省总医院Shaw于2009年在临床肿瘤杂志《J Clin Oncol》上发表论文，对EML4-ALK融合基因阳性肺癌患者的临床及病理学特征进行了描述，探讨了其对于化疗及EGFR-TKI药物疗效的影响。EML4-ALK阳性者中，年轻患者、男性患者比例较高，不吸烟或轻度吸烟患者较多，绝大多数组织学检查结果为腺癌，且大部分为印戒细胞亚型。且与EGFR突变和KRAS突变多不会同时出现：即具有EML4-ALK融合基因的患者多为EGFR和KRAS野生型；而EGFR和（或）KRAS突变的患者多不具有EML4-ALK融合基因。与疗效的相关性分析显示，EML4-ALK阳性与EGFR-TKI耐药明显相关，EGFR-TKI治疗在10例EML4-ALK阳性患者中均显示无效。然而，EML4-ALK阳性患者和阴性患者的缓解率相似，且至疾病进展时间也相当。

4 EML4-ALK融合基因的生物学功能

研究者研究了EML4-ALK融合基因的各个功能区，其中的两个区在各个亚型中均包含，即：EML4基因片段中的basic区及ALK基因的kinase区。EML4具有使该融合基因产物蛋白二聚化的功能，而ALK基因的膜内催化区域能在形成二聚体时激活，其异常激活导致细胞的癌变。Soda[21]等通过构建缺失EML4 Basic区、HELP区、WD区的质粒的3T3细胞，接种裸鼠后发现，缺失EML4 Basic区的完全不能成瘤，而缺失HELP区和WD区的均能成瘤，但瘤体较小，提示各功能区在肺癌的转化过程中均发挥作用，但Basic 区的作用可能最为重要。而kinase区为ALK基因的膜内催化区域，其激活后通过相关信号通路调控细胞增殖、存活和迁移。

Soda 等将携带EML4-ALK 基因的质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞3T3，而使后者获得了致瘤性，接种于裸鼠皮下后成瘤。而在携带EML4-ALK的所有转基因小鼠的肺组织中，自发性形成数百个腺癌病灶；这种转基因的小鼠在口服ALK激酶的抑制剂后，肿瘤均趋于消失；而在静脉注射转染EML4-ALK的3T3细胞后，小鼠均由于呼吸衰竭而死亡，而使用ALK激酶抑制剂后，能明显延长这些小鼠的生存时间。Lin E等[31]为进一步研究其功能，在转染沉默5’EML4和3’ALK的siRNA后，在部分细胞中出现生长抑制，而将沉默EML4-ALK基因的siRNA转染至A549和H838细胞系，这两种细胞系均为EML4-ALK野生型，结果这些细胞系均无生长抑制，说明EML4-ALK基因在阳性肿瘤细胞发生，生长过程中起到非常重要的作用。

目前研究发现EML4-ALK融合基因与STAT3，AKT/PI3K及RAS/ERK等信号通路有关系。转录因子C/EBPβ（CCAAT/enhancer binding protein beta）具有提高细胞增殖和生存能力。ALK基因通过STAT3信号通路，提高C/EBPβ的mRNA及蛋白水平；还通过ERK1/2磷酸化C/EBPβ的第235位苏氨酸，激活C/EBPβ蛋白[37]。研究发现ALK也可以通过SHH/GLI1信号通路发挥作用，且可激活AKT/PI3K信号通路稳定GLI1蛋白[38]。此外，Ken Takezawa等报道，EML4-ALK与ERK-BIM 和STAT3-Survivin 信号通路有关， 而ALK抑制剂引起的细胞凋亡可能是通过抑制了BRK信号通路导致的BIM上调以及STAT3信号通路抑制后下调了survivin 引起的。

5 ALK抑制剂的临床应用前景

目前，针对ALK基因的小分子抑制剂Crizotinib（PF02341006）正处于多项临床试验研究阶段，Kwak于2009年ASCO年会上报告ALK抑制剂Crizotinib （PF-02341066）治疗19例EML4-ALK阳性的NSCLC患者，取得令人鼓舞的53％的有效率，之后，在第46届ASCO年会上，辉瑞公司的crizotinibⅠ/Ⅱ期临床实验结果发布。这项研究由来自韩国首尔国立大学医学院的Yung-Jue Bang博士主持，该研究采用荧光原位杂交技术（FISH）检测患者是否携带ALK融合基因，共入组了82例携带ALK融合的NSCLC患者，既往接受治疗的中位次数为3次。所有患者均口服Crizotinib 250mg。结果显示，客观缓解率为57％，缓解持续时间1～15个月。＞90％的患者肿瘤缩小大于30％。8周疾病控制率（DCR）为87％，约72％的患者6个月无疾病进展。其结果进一步验证了Kwak等的报道。研究者认为，对于携带EML4-ALK融合基因的NSCLC患者，Crizotinib治疗的缓解率高，且安全性良好。目前， Crizotinib Ⅲ期临床试验正在进行中。

Yongjun Li等[39]近期通过两种分子抑制剂进一步研究非小细胞肺癌EML4-ALK融合蛋白的功能，分子抑制剂选取ALK SMI TAE684及 PF2341066（是临床正在发展的一种c-met及ALK双重抑制剂）[40]，研究其对表达EML4-ALK三型的细胞株H2228细胞株包括EML4 1-6外显子及其体外移植瘤的抑制作用[41-44]。另外，还比较了TAE684与PF2341066的疗效。结果发现，EML4-ALK融合基因有与NPM-ALK相似的信号通路，包括Akt、ERK、STAT3，这些信号通路都可以被TAE684抑制。TAE684降低H2228细胞株活性，这种抑制呈剂量依赖性，IC50为15nm，通过CASPASE3、7活性升高及annexin V染色证实诱发凋亡。抑制剂处理24小时后，96％细胞停止在G1期，对照组为56％。上述结果表明，TAE684通过促进凋亡和抑制细胞增殖来抑制细胞生长，而抑制细胞增殖为主要原因。 另外，TAE684还抑制ALK蛋白激活以及下游信号的传导，结果表明，在H2228中EML4-ALK激活ERKPI3K STAT信号通路，与NPM-ALK在ALCL细胞株中的作用相似。

在体外构建移植瘤的实验中，已有研究证实，TAE684诱导表达NPM-ALK融合基因的淋巴瘤生长抑制，如果EML4-ALK是非小细胞肺癌癌基因驱动因子，那么该抑制剂也应该对这些肿瘤有相似的作用。为了验证这个假说，作者构建了H2228动物模型。结果表明，该抑制剂对A549动物模型没有抑制作用（A549细胞不表达融合基因，并且KRAS突变，EGFR野生型）[45]，而在H2228动物模型出现完全的生长抑制作用，该结果说明，TAE684特异性地抑制H2228的EML4-ALK。另外，比较TAE684与PF2341066的疗效，无论在体内还是在体外研究中，PF2341066疗效均不如TAE684。

6 展望

综上所述，与其他分子靶标和靶向药物相比，EML4-ALK的研究历程才刚开始，EML4-ALK阳性患者的临床特征与EGFR突变者相似，但并不能从EGFR-TKI靶向治疗中获益。故对拟行TKI治疗的患者，可以首先检测KRAS突变状态，排除阳性后对KRAS阴性者进行EGFR突变检测；若EGFR突变阳性，选择TKI治疗，阴性则继续行EML4- ALK检测；若EML4-ALK阳性者，需要尝试针对ALK的靶向治疗。由此，我们认为EML4-ALK是对NSCLC个体化治疗检测的进一步丰富和完善，我们有理由相信，EML4-ALK融合基因作为具有独特临床特征肺癌的又一分子标志物，昭示着针对ALK的靶向治疗将促使肺癌个体化治疗更加精准有效和逐步走向成熟完善。针对这一靶点的深入研究，将有助于筛选EGFR-TKI合适的治疗人群并开创EGFR-TKI耐药的NSCLC靶向治疗新领域。

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