肿瘤干细胞分离鉴定方法的研究进展

程俊美 谢 峰 王 慧

山东菏泽医学专科学校病理学教研室

早在19世纪中期就有科学家在显微镜下发现肿瘤细胞与干细胞十分形似。到20世纪50年代前后，Lorentz等的骨髓移植实验成功，表明在造血细胞中存在一类原始的造血细胞即造血干细胞(HSC)，它们具有自我更新或自我复制的能力，能向骨髓中的各系细胞分化，以维持机体的正常造血功能。许多学者提出肿瘤干细胞(CSC)假说，Reya等[1]认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞充当干细胞的角色，具有无限增殖的潜能，在启动肿瘤的形成和生长中起着决定性的作用。

之后，研究者们又从人和动物的多种肿瘤及肿瘤细胞系中分离鉴定出了CSC。根据目前已有的研究，对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方法，即依赖于细胞表面标志的分离方法和根据干细胞外排DNA结合荧光染料Hoechst33342而建立的SP细胞分离法。

1 依赖细胞表面标志的分离方法

要通过表面标志对CSC进行分离，必须确定CSC的特异性表面标志(或标志物组合)。考虑到CSC既属于肿瘤细胞也类似于正常干细胞的特性，对CSC分离标志选择的一般原则为：结合谱系标志——CSC一般不表达分化的谱系标志即Lin-(谱系标志：CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64、CD140b)；正常干细胞特异性标志——如分离BTSC的CD133和分离LSC的CD34[2]等；以及正常组织特异性标志——如分离乳腺癌的上皮特异性标志ESA等进行综合评价；除此之外，结合阳性标志和阴性标志可以更有效地分离肿瘤干细胞。目前，已经用这种方法分离鉴定出了多种肿瘤的CSC。

1.1 造血系统肿瘤干细胞1997年，Bonnet等用放射线照射非糖尿病型重症联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠，破坏其骨髓后导入人造血干细胞，观察到有新的血细胞产生。他们又用同样的方法发现只有很少的急性髓细胞白血病(AML)细胞可在小鼠体内形成AML移植瘤，用各种细胞表面标志对这些AML的起始细胞进行研究，发现这些细胞并不带有成熟细胞的标志物，而是表型为CD34+CD38-的细胞亚群。该细胞群具有明显的增殖、分化和自我更新能力，只需要5×103就可以在NOD/SCID小鼠体内形成AML。尽管这些细胞只占AML细胞的0.2%，但它们是唯一能在NOD/SCID小鼠体内形成移植瘤的细胞，故CD34+CD38-表型的细胞就被认为可能是LSC。Passegue等[3]进一步证实了CD34+CD38-Thy-1-的细胞是LSC。正常造血干细胞的表型则为CD34+CD38-Thy-1+，两者非常相似。所以，LSC可能来源于的Thy-1-祖细胞，或者是丧失了Thy-1+表达能力的干细胞。

1.2 实体瘤肿瘤干细胞

1.2.1 乳腺癌与肿瘤干细胞 Al-Hajj等[4]将人乳腺癌组织的细胞接种到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪组织中，建立了可靠的人乳腺癌起始细胞(BrCa-IC)体内试验模型，并初步用与乳腺癌细胞相关的表面分子CD44和CD22、乳腺/卵巢癌特异性标志(B38.1)及上皮细胞特异性抗原，鉴定了BrCa-IC即乳腺癌肿瘤干细胞，提出乳腺癌组织中表面分子为ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的细胞是乳腺癌CSC 。虽然这些细胞只占所有乳腺癌肿瘤细胞的2%，但是其重建肿瘤的能力却是其它表型肿瘤细胞的50倍。在此次实验中，研究者切除移植瘤后分离出ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的细胞移植于下一个小鼠体内，发现只需要200个该表型的细胞就能成瘤，反复移植发现ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的肿瘤细胞均能在下一个小鼠体内形成与原发瘤类似的肿瘤，产生的新肿瘤中不仅含有ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的肿瘤细胞，还有表型各异的其它肿瘤细胞。这一特征与干细胞能自我更新和产生表型各异的子代细胞的特征相似。

1.2.2 脑肿瘤与肿瘤干细胞 2002年，Ignatova等[5]报道了在人皮质神经胶质瘤中包含神经干细胞样的细胞。2003年，Singh等[2]从不同类型的脑肿瘤中分离和鉴定出细胞表面标志为CD133+表型的一类细胞，发现只有这类肿瘤细胞能在体外培养中形成肿瘤球，并且能不断增殖、自我更新、分化，更重要的是形成的肿瘤球中没有分化成熟的神经细胞、星形胶质细胞的标志，而且CD133+的脑肿瘤细胞可在裸鼠体内形成肿瘤；而CD133-的肿瘤细胞则贴壁并丧失增殖和分化能力，在裸鼠体内也无致瘤能力。故他们将CD133+的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞(BTSC)。BTSC与正常神经干细胞有相似的细胞表面标志，占整个肿瘤细胞总数的3.5%～46.3%。Hemmati等[6]通过对小儿脑部肿瘤的研究也得到相似的结果，认为肿瘤来源的神经球可能就是CSC，该细胞移植到小鼠大脑后能增殖分化，并发现BTSC除表达CD133外，还表达Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的基因特征。

1.2.3 结直肠癌与肿瘤干细胞 2006年，Brien[7]等利用结肠癌患者的肿瘤新鲜样本做成肿瘤细胞悬液，用CD133抗体标记后注入NOD/SCID小鼠体内，结果CD133+的细胞只需要500个即可以成瘤，而CD133-的细胞几乎不能成瘤，未做标记的肿瘤细胞悬液需要最少1×105个才能100%成瘤，将CD133+的NOD/SCID小鼠的肿瘤细胞再次移植到新的NOD/SCID小鼠体内，结果相同。而且新形成的肿瘤与原来肿瘤的表型异质性相似。Ricci-Vitiani等[8]也完成了同样的研究，他们认为占结直肠癌细胞总数约2.5%的CD133+细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。最近，Dalerba等[9]又发现上皮细胞黏附分子、CD44、CD166可以作为鉴定结直肠癌干细胞的细胞表面标志。

2 SP细胞分离方法

目前还有一种不需细胞表面标志而分离CSC的方法——根据干细胞外排DNA结合染料Hoechst33342的生物学特性而应用流式细胞仪进行分选。

Hoechst33342是一种脂溶性的蓝色荧光染料，可以穿透细胞膜与DNA结合，常用于细胞凋亡的检测，也用于普通的细胞核染色或常规DNA染色，细胞染色后用荧光显微镜或流式细胞仪检测。1996年，Goodell等首次提出在Hoechst33342染色的骨髓细胞中存在着一群染色很浅的细胞群，通过紫外激发后用双波长分别为450nm的蓝色荧光和675nm的红色荧光分析，其中有不到0.1%的细胞发出微弱的蓝光和红光，在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧，因此被称为侧群(SP)细胞。该群细胞体积较小，大多处于G0～G1或S～G2M期，并且能表达干细胞的标志(Sca-1+Lin-/low)，在移植实验中也表现出造血干细胞的特点。随后的研究表明该细胞群广泛分布于人以及恒河猴、猪、小鼠、大鼠等多种动物的骨髓、胎肝、脐血、外周血等造血组织和血液中[10-12]。除了造血系统和血液外，SP细胞存在于人和动物的许多重要器官，如肝、肺、脾、肾、脑、神经、骨骼肌、心肌、睾丸、皮肤、胰腺、小肠、气管等，参与了相应组织的更新与再生、器官系统的自我重建以及成体干细胞的多器官可塑性[13-15]。

与此同时，研究者还对分离出的SP细胞的细胞特性进行了研究，发现其具有很多类似干细胞的特性。最早在Goodell等的致死量照射鼠的造血系统重建实验中，就发现SP细胞的扩增倍数大约为1000倍，体现出干细胞长期增殖的特点。Benchaouir等[16]发现多数SP细胞是处于G0期的静止细胞，用电镜观察其超微结构，可以发现细胞内大多是滑面内质网，缺少粗面内质网和核糖体，这些特征多与细胞的低代谢活性有关；进一步分析其基因表达情况，发现SP细胞的转录能力与NSP细胞相比大幅降低，细胞内与细胞周期停滞相关的基因表达上调，而与细胞周期运行相关的基因表达下调，符合干细胞的慢周期特征。此外，SP细胞还具有多向分化潜能，在体外诱导下可以分化为多种组织细胞类型。最初的研究表明，来源于骨髓的SP细胞具有很强的重建造血系统的能力。

综上所述，目前已有越来越多的研究证明SP细胞广泛存在于人和动物的多种成体组织、实体瘤及肿瘤细胞系中，并具有干细胞样特征。因此对SP细胞的研究不仅有助于增加人们对干细胞各种特性的理解，而且也提供了一种从组织细胞或肿瘤细胞中分离纯化和利用干细胞的策略，尤其是在干细胞表面标志物不明的情况下更是如此。

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