蜗牛水解液的制备及其乳酸发酵饮料的研究

张甜甜， 陈存社， 侯建军， 任雅琳

(北京工商大学食品学院，北京 100048)

蜗牛水解液的制备及其乳酸发酵饮料的研究

张甜甜， 陈存社， 侯建军， 任雅琳

(北京工商大学食品学院，北京 100048)

用碱性蛋白酶对白玉蜗牛肉进行水解，探讨了水解温度、pH值、加酶量及固液比对蜗牛肉水解液水解得率的影响，通过正交试验确定了蜗牛肉水解的较佳条件，并以水解液为原料进行乳酸菌发酵，获得较佳的饮料制备工艺．结果表明:以碱性蛋白酶为水解酶，水解工艺条件为，温度50℃，pH 10.5，料液比1∶5，加酶量6 000 U/g，水解3 h后加1%风味蛋白酶水解1 h时水解度为7.13%．水解液乳酸菌发酵的较佳工艺条件为:115℃高温灭菌15 min，蔗糖添加量5%，乳糖添加量2%，乳酸菌接种量3% ～4%，时间6 h．

蜗牛;水解度;发酵;饮料

白玉蜗牛，也称褐云玛瑙螺，是陆生贝壳类的软体动物，属腹足纲，原产于非洲东部．白玉蜗牛肉质鲜美，营养丰富，含有20多种氨基酸 ，可以加工为多种食品和保健品，具有较高的食用和药用价值［1－2］．据分析:100 g褐云玛瑙螺干肉含蛋白质60.42 g，脂肪 3.85 g，粗纤维 4.5 g，无氮浸出物18.9 g，灰分 9.6 g，以及钙、磷、生物碱、酚类、鞣酸、肉酯、香豆精、有机酸和维生素等，还含有大量的硒、硼、锌等微量元素［3］．以蜗牛肉为原料 ，采用酶解生产的蜗牛蛋白水解液，还可用作高级调料或调配成保健品直接饮用［4］．此外，蜗牛肉经过酶解得到的蜗牛全营养液蛋白质和氨基酸含量高，适当添加该提取液可以提高食品、化妆品的价值［5－7］．

我国是蜗牛养殖大国，资源极为丰富．蜗牛主要以烹调为主，少量用于药品和其他方面．目前，市场上主要的蛋白水解液为植物蛋白水解液，其氨基酸组成和比例都与人体需求差异较大．动物蛋白水解液与人体氨基酸组成相似，但由于原料安全得不到保障，市场上动物源水解液较少．宋焕禄［8］等利用盐酸水解蜗牛肉粉后中和得到的蜗牛蛋白水解液蛋白水解率高，氨基酸态氮得率达50%．郭玉华［9］和白凤翎［10］利用菠萝蛋白酶水解牡蛎蛋白，并用乳酸菌发酵水解液得到乳酸发酵饮料，其中含有大量的低分子多肽，易吸收，而且蛋白水解物也能促进乳酸菌的增殖．刘姝［11］等利用米曲霉 Aspergillus oryzae AS3.951发酵太平洋牡蛎，制备水解液，也是动物水解液的新探索．张昌奎［12］等利用Protamex Flavourzyme酶水解蜗牛肉并对水解液进行了脱色和脱腥研究，得到色泽浅、无腥味的蛋白水解液．利用碱性蛋白酶水解蜗牛肉的研究较少，并且利用蜗牛肉水解液进行乳酸菌发酵得到发酵饮料也是本研究的创新点．利用酶水解的动物蛋白水解液不仅营养价值高，口味较好，其乳酸菌发酵饮料也利于肠道吸收，可以实现蜗牛的高值化利用，为蜗牛乳酸菌饮料的开发利用提供理论依据和实践指导．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料

白玉蜗牛，购自北京市海淀区四道口水产批发市场;脱脂奶粉，完达山产品(批号:3601B412);脱脂牛奶培养基，用于菌种活化和短期传代保存．

1.1.2 酶制剂

碱性蛋白酶，北京奥博星生物技术有限公司，活力20万U/g;风味蛋白酶，诺维信公司．

1.1.3 试剂

乳糖、蔗糖，其他试剂均为国产分析纯．

1.1.4 菌种

嗜热链球菌(S．theumopHilus，St)，由中科院微生物所提供;

保加利亚乳杆菌(L．bulgaricus，Lb)，由中科院微生物所提供．

1.2 实验仪器

DS－1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂 ;HH－2型数显恒温水浴锅，杰瑞尔电器有限公司;PHS－3D型精密pH计，上海精密科学仪器有限公司;HJ－1型磁力搅拌器，江苏金坛医疗仪器厂;Scout型电子天平，奥豪斯国际贸易有限公司;LRH－250型生化恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司;超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;高剪切均质乳化机;上海世赫机电设备有限公司;Himac CR22G型高速冷冻离心机，日本Hitachi公司．

1.3 实验方法

1.3.1 蜗牛蛋白的酶水解［4］

将静养2 d的蜗牛用水清洗干净，放入沸水中，30 s后取出，将蜗牛肉取出，称取一定量的蜗牛肉加入不同比例去离子水，用绞肉机将蜗牛肉绞碎．调节蜗牛肉的pH值，以碱性蛋白酶为水解酶，在不同的水解温度、加酶量和固液比条件下分别酶解3 h，加入1%的风味蛋白酶继续酶解1 h以改善酶解液风味［13］．酶解液95℃水浴5 min灭酶，酶解液5000 r·min－1离心 10 min 后得清液备用．

1.3.2 蜗牛蛋白水解条件优化

在单因素实验的基础上，选用碱性蛋白酶的水解温度、pH值、酶添加量和固液比作为试验因素，如表1．选取L9(34)正交试验探讨碱性蛋白酶水解的较佳工艺条件．

1.3.3 水解度的测定

分别采用凯氏定氮法［14］和中性甲醛滴定法［15］测定蜗牛肉蛋白总氮含量和水解液中游离氨基态氮含量．

表1 L9(34)碱性蛋白酶水解正交试验设计Tab．1 Design of L9(34)alkali protease hydrolysis orthogonal test

1.3.4 蜗牛水解液的调配

实验发现，单独发酵蜗牛酶解液时因糖的缺乏会导致乳酸菌不能很好地生长繁殖，也不能产生足够的乳酸，加入蔗糖、乳糖可使乳酸菌充分生长繁殖，发酵产酸，增加产酸量［16］．因此添加不同浓度的蔗糖和乳糖调配后灭菌进行乳酸菌发酵．

1.3.5 蜗牛水解液乳酸菌发酵［17］

根据发酵型乳酸菌饮料制备方法，将获得的蜗牛水解离心上清液，分别加入不同质量分数的蔗糖和乳糖调配，在115℃高温灭菌15 min，冷却后按嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的比例为St∶Lb=1∶1，接种量为3% ～4%，42 ℃培养，分别发酵 4，5，6，7，8 h．测定发酵液的pH值和酸度，并进行感官评分．

1.3.6 灭菌温度对蜗牛乳酸菌发酵饮料的影响实验

为确定蜗牛水解液发酵饮料的最佳灭菌温度，将蜗牛水解液添加一定量白砂糖和乳糖调配后分别在115℃和120℃灭菌15 min，迅速冷却，观察蜗牛水解液的状态．

1.3.7 发酵时间对发酵型蜗牛乳酸菌饮料的影响实验

为研究不同发酵时间对蜗牛水解液发酵饮料产品的质量和口感的影响，将水解液调配后灭菌，接种乳酸菌后在42 ℃发酵 4，5，6，7，8 h，测定不同发酵时间发酵液pH值和酸度，并进行感官评分．

1.3.8 发酵液酸度的测定

分别采用pH计和滴定法［18］测定乳酸菌发酵液的pH值和酸度．

1.3.9 发酵液沉淀率SR的测定［19］

在产品贮藏几天后，对产品进行离心沉淀测试．称取10 mL样品到离心管中，常温下以3 000 r/min的转速旋转10 min，离心后倒出上层液体，再将离心管倒置5 min后称重．每个样品进行3次平行测定，结果取平行测定的平均值．

2 结果与讨论

2.1 碱性蛋白酶水解条件的优化结果

碱性蛋白酶水解蜗牛肉的正交试验结果如表2．由表2可以看出，影响水解度的主次因素是:D＞A＞B＞C，即固液比＞水解温度＞pH＞加酶量．试验结果表明，水解得率最高的酶解工艺组合为A3B2C1D1，水解度为7.13%．因此确定了碱性蛋白酶水解蜗牛肉的较佳酶解条件:水解温度50℃，pH 10.5，料液比1∶5，加酶量 6 000 U/g，为改善蜗牛水解液的风味，在碱性蛋白酶水解3 h后加入1%风味蛋白酶继续水解1 h．

表2 L9(34)碱性蛋白酶水解正交试验结果Tab．2 L9(34)Alkali protease hydrolysis orthogonal test results

2.2 蜗牛水解液乳酸饮料发酵结果分析

2.2.1 蜗牛水解液调配中乳糖添加量对蜗牛乳酸发酵饮料的影响

蜗牛酶水解液中含糖量较少，发酵蜗牛水解液时因糖的缺乏会导致乳酸菌不能很好地生长繁殖，因此也不能产生足够的乳酸．加入蔗糖、乳糖可使乳酸菌充分生长繁殖，发酵产酸，增加产酸量．加入不同含量乳糖和蔗糖后蜗牛乳酸菌发酵6 h后的pH值、酸度和感官评价如表3和表4．

由表3看出，随着乳糖添加量的增加，滴定酸度逐渐增加，当乳糖添加量大于2%时，滴定酸度上升趋势比较缓慢，因此乳糖添加量在2%时较佳．

表3 乳糖添加量对蜗牛乳酸菌发酵饮料的影响Tab．3 Effect of lactose content on snail lactobacillus fermented beverage

表4 蔗糖添加量对蜗牛乳酸菌发酵饮料的影响Tab．4 Effect of sucrose content on snail lactobacillus fermented beverage

加入适当的蔗糖可以为乳酸菌提供碳源，促进乳酸菌的生长繁殖，发酵产酸，增加产酸量，使产品产生良好的风味和口感．若添加量过大，会产生高渗透压，抑制乳酸菌的生长繁殖;添加量过小，风味较差．由表4可以看出，随着蔗糖添加量的增加，感官评分升高，当蔗糖添加量为5%，感官评分较高，与蔗糖添加量为7%的感官评分无显著性差异．

2.2.2 灭菌温度对蜗牛乳酸菌发酵饮料的影响

为研究灭菌温度对蜗牛乳酸菌发酵饮料的影响，将蜗牛水解液添加一定量蔗糖和乳糖调配后，分别在115℃和120℃条件下灭菌，持续15 min，迅速冷却，观察蜗牛水解液的状态．发现在115℃灭菌后蜗牛液的色泽较好，无沉淀，在120℃灭菌后有大量褐色沉淀，因此确定蜗牛水解液的灭菌条件为115 ℃，15 min．

2.2.3 发酵时间对发酵型蜗牛乳酸菌饮料的影响

将调配好的蜗牛水解液灭菌后，接种乳酸菌发酵，测定不同发酵时间发酵液pH值和酸度，并进行感官评分，结果见表5．

由表5可见，发酵时间对产品的质量和口感都有较大的影响，时间过短，风味不足，口感较差;时间过长，产酸量过多，风味不佳，生产效率较低，生产成本过高．当然，最佳的发酵时间与发酵剂的活力和发酵温度有密切关系，生产中应根据实际情况确定．从表5综合考虑感官评分和生产效率，时间达6 h为较佳发酵时间．

表5 发酵时间对蜗牛乳酸菌发酵饮料的影响Tab．5 Effect of fermentation time on snail lactobacillus fermented beverage

2.2.4 蜗牛水解发酵饮料出现的问题

通过多次蜗牛水解发酵饮料的制备实验发现，随着发酵时间的延长，蜗牛发酵饮料会出现沉淀和分层现象．产品贮藏几天后，对产品进行离心沉淀测试．发现调配好的蜗牛水解液在42℃发酵9 h，冷冻12 h后沉淀率达2.3%，而一般地，产品离心沉降率在1%以内认为比较稳定［20］，大于1%的，越大越不稳定．为降低饮料的沉淀率和提高发酵饮料的稳定性［21］，在饮料中加入不同含量的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，发现随着CMC-Na添加量增加，离心沉淀率先降低后增加，稳定剂的添加量超过一定值时，反而引起乳酸菌发酵饮料更加不稳定，其主要原因可能是，稳定剂加入过多，饮料颗粒表面吸附的稳定剂链节数会过多或链节的吸附占极大优势，沉淀会从稳定剂分子上解吸［22］．

3 讨论

本实验选用碱性蛋白酶对白玉蜗牛肉水解，并通过正交试验对水解条件进行优化，确定了蜗牛肉水解的较佳条件．蜗牛水解液中含有大量的短分子多肽，利用蜗牛水解液添加5%蔗糖和2%乳糖调配的蜗牛水解液灭菌后接种乳酸菌发酵，并研究了乳糖和蔗糖添加量对乳酸发酵饮料口味的影响．发现在蔗糖添加量5%，乳糖添加量2%，乳酸发酵饮料的酸度和口味较好．在实验中出现了蜗牛水解液在发酵过程中的沉淀和不稳定问题．发酵型蜗牛饮料的营养成分分析和其贮存过程中出现的问题将是以后研究中应重点研究的方向．此外蜗牛乳酸菌饮料的保健作用也有待进一步研究．

［1］陈曾逸．蜗牛系列产品开发与利用［J］．农牧产品开发，1996(9):11-13．

［2］黄振东，严得胜．蜗牛［J］．生物学通报，2002，37(12):16．

［3］沈忠明．出口褐云玛瑙螺蜗牛肉干营养成分的研究［J］．四川畜牧兽医学院学报，1999，13(4):33-37．

［4］张昌奎，唐家礼，谭汝成．改善蜗牛肉蛋白水解液色泽和风味的研究［J］．广州食品工业科技，2000(4):48-49．

［5］乌力吉．全蜗牛营养液提取改进工艺:中国，CN 1119534［P］．1996-04-03．

［6］Brieva A，Guerrero A，Pivel J P．Biochemical and pharmacological mechanism related to the activity of cryptomphalus aspersa(SCA)(Endocare®)in radiodermatitis［J］．Dermatol Cosmet，2001，11(2):71-75．

［7］Smith A M，Callow J A．Biological adhesives［M］∥The biochemistry and mechanics of gastropod adhesive gels．Heidelberg:Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH ＆ Co KG，2006:167-182．

［8］宋焕禄，刘雪妮，陈功如．一种蜗牛蛋白水解液及其制备方法:中国，201110165244［P］．2011-12-21．

［9］郭玉华．牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究［D］．青岛:中国海洋大学，2008．

［10］白凤翎．蛋白水解物促乳酸菌增殖及高密度培养体系研究［D］．北京:北京林业大学，2010．

［11］刘姝，房耀维，王淑军，等．微生物发酵法制备太平洋牡蛎水解液［J］．食品与发酵工业，2012，38(3):105-108．

［12］张昌奎，唐家礼，谭汝成．改善蜗牛肉蛋白水解液色泽和风味的研究［J］．广州食品工业科技，2000(4):48-49．

［13］曹川，朱文广，包建强．贻贝肉酶解液的脱苦脱腥研究［J］．江苏农业科学，2012，40(2):216-218．

［14］全国饮料工业标准化技术委员会．GB/T 6432—1994饲料中粗蛋白测定方法［S］．北京:中国标准出版社，1994．

［15］卫生部食品卫生监督检验所．GB 5009.5—2010 食品中蛋白质的测定［S］．北京:中国标准出版社，2010．

［16］曾传广，余有贵．米皮水解液发酵乳酸菌饮料的工艺研究［J］．中国酿造，2008(9):100-102．

［17］徐 莹，刘文磊，姜凯元，等．牡蛎萝卜汁的乳酸菌发酵研究［J］．中国酿造，2010(5):85-88．

［18］黄伟坤．食品检验与分析［M］．北京:中国轻工业出版社，1989:49-52．

［19］赵宇星．发酵型酸豆乳饮料的研究［D］．无锡:江南大学，2005．

［20］杨海红．卡拉胶及糖、盐存在时对勾对牛奶酒稳定性的影响［J］．无锡轻工大学学报，2003，22(1):29-30．

［21］赵晓丽，李洁慧，宫春波，等．稳定剂添加对发酵型酸奶发酵效果的影响［J］．中国食品添加剂，2011(1):182-186．

［22］李彦荣．果汁豆奶的制备及其稳定性研究［D］．无锡:江南大学，2006．

(责任编辑:叶红波)

Study on Preparation of Snail Hydrolyzate and Application in Fermentation Beverage

ZHANG Tian-tian， CHEN Cun-she， HOU Jian-jun， REN Ya-lin
(School of Food and Chemical Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

Hydrolysis of snail meat with alkali protease was determined by orthogonal test and the application of snail hydrolyzate in fermentation beverage were studied．The optimal conditions of snail meat hydrolysis were temperature 50℃，pH 10.5，solid-liquid rate 1∶5，and alkali protease dosage of 6000 U/g．After 3 h of hydrolysis，1%of flavourzyme was added to improve the flavor．Supernatant of hydrolyzate was sterilized at 115℃ for 15 min．With fermentation at temperature 40℃，sugar 5%，inoculum 3% －4%，and lactose 2%for 6 h，the beverage obtained had good color and flavour，and also showed high stability．

snail;degree of hydrolysis;fermentation;beverage

TS251;TS275.4

A

1671-1513(2012)06-0063-04

2012-02-22

北京市教委科技发展计划项目(KZ20110011013);学科与研究生教育重点学科应用化学资助项目(PXM2012_014213_000038)．

张甜甜，女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程;

陈存社，男，教授，博士，主要从事发酵食品方面的研究．通讯作者．