灯盏花素对糖尿病大鼠肾皮质糖基化终产物受体mRNA表达的影响

孙洁敏 马晓兰 沈建国 姚美芬 李璐璐 李 琦

随着胰岛素的广泛应用和各种口服抗糖尿病药的发现，目前严重影响糖尿病患者生存质量的主要原因是各种并发症。其中糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是最为严重的并发症之一。近年来国内外大量研究表明晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)及其受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)以及氧化应激在DN的发生发展中起到了很大的作用［1］。灯盏花(erigeronbreviscapus，EB)又名灯盏细辛，为菊科植物短葶飞蓬的全草，为一种植物药。目前的研究发现它能通过抑制氧化应激和增强机体的抗氧化作用来防治糖尿病肾病［2］。本实验采用单次腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱发的大鼠糖尿病模型，用半定量反转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)方法观察其肾皮质RAGE mRNA的表达，旨在阐明灯盏花素对肾皮质RAGE mRNA表达的影响，以表明其对糖尿病肾病的防治作用，为DN的防治提供实验依据和新的方法。

材料与方法

1．材料:选用浙江大学医学院附属第一医院动物实验室培育的Sprague－Dawley(SD)雄性大鼠。主要试剂有灯盏花素片(上海雷允上药业有限公司)，链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司。

2．方法:(1)动物模型的建立和分组 SD雄性大鼠27只，体重230～280g。随机分为以下3组:正常对照组(C组)9只，糖尿病安慰剂组(D组)9只，糖尿病灯盏花素治疗组(DD组)9只。饲养10天后禁食12h，D组和DD组予一次性腹腔注射65mg/kg链脲佐菌素(STZ)，C组予一次性腹腔注射同等剂量的柠檬酸钠缓冲液，72h后尾静脉测血糖，以血糖 ＞16.7mmol/L确定为造模成功。其中DD组2只，D组1只血糖＜16．7mmol/L，3天后补注STZ(以15mg/kg体重剂量腹腔注射)，72h后测血糖＞16．7mmol/L。DD组每日给予灯盏花素混悬液［20mg/(kg·d)］灌胃。D组和C组每日给予同等剂量的生理盐水灌胃。每隔2周称体重测血糖1次。(2)RTPCR检测肾皮质中RAGE mRNA的表达:①8周后，取肾皮质100mg提取RNA;②用紫外分光光度计测定RNA;③反转录合成cDNA;④PCR:分别进行RAGE及β－actin扩增;⑤PCR产物分析:取PCR产物5μl，上样于琼脂糖凝胶中，电泳至凝胶全长的2/3后，照相记录。用G:BOX SYNGENE凝胶成像仪得电泳图像。扫描特异性条带的密度，取得光密度(optical density，OD)值。得出相对单位(相对单位=RAGE OD值/β－actin OD值)。

3．统计学方法:采用SPSS 16．0统计软件进行统计分析，数据均行正态分布检验及方差齐性检验，正态分布数据用均值±标准差表示，3组间比较用方差分析，两组间比较采用t检验。p＜0．05表示有统计学意义。

结 果

3组大鼠成模时的体重无显著性差异(P＞0.05);组间比较D组和DD组血糖同C组相比有显著差异(p＜0．01)，DD组与D组间血糖无显著性差异(P ＞0．05);而在成模2、4、6、8 周时，D 组和 DD 组与C组大鼠比较，体重、血糖均有显著性差异(p＜0.01)，而D组和DD组之间体重、血糖无显著性差异(P ＞0．05)(表1)。

表1 大鼠成模用药后3组大鼠体重、血糖测定)

表1 大鼠成模用药后3组大鼠体重、血糖测定)

与C组比较，*p＜0．01;D组老鼠有2只分别死于第5周及第7周

周数 组别 n 体重(g) 血糖(mmol/L)0 DD 9 297．86 ±42．95 27．77 ±3．46*D 9 295．44 ±13．11 30．23 ±3．06*C 9 302．00 ±14．37 5．62 ±0．24 2 DD 9 315．00 ±47．69* 31．11 ±4．03*D 9 285．11 ±14．72* 29．50 ±2．77*C 9 348．22 ±28．88 6．43 ±0．50 4 DD 9 310．86 ±49．10* 30．36 ±4．12*D 8 281．88 ±16．17* 32．20 ±2．59*C 9 388．89 ±36．78 5．95 ±0．42 6 DD 9 314．86 ±29．59* 31．65 ±1．46*D 8 298．84 ±23．04* 32．14 ±2．59*C 9 421．44 ±35．42 5．95 ±0．33 8 DD 9 291．00 ±30．19* 30．98 ±3．26*D 7 281．10 ±19．99* 31．30 ±1．52*C 9 453．31 ±50．53 6．28 ±0．40

实验8周后，糖尿病大鼠肾皮质内RAGE表达较高与正常大鼠肾皮质内RAGE表达相比有显著性差异(p＜0．01)。经灯盏花素治疗后(DD组)RAGE mRNA的表达水平与D组相比有明显降低，具有显著性差异(p＜0．01)(表2)。3组大鼠肾皮质RTPCR产物琼脂糖电泳(图1)。

表2 各组大鼠肾皮质RAGE mRNA的表达

表2 各组大鼠肾皮质RAGE mRNA的表达

与C组比较，*P ＜ 0．01;与D组比较，▲P ＜ 0．01

组别 n RAGE OD值/β－actin OD值DD 9 0．452 ±0．208＊▲D 70．769 ±0．104*0．218 ±0．032 C 9

图1 糖尿病大鼠肾皮质RT－PCR产物琼脂糖电泳

讨 论

在糖尿病病人中，持续性的高血糖及氧化应激使得蛋白质尤其是长效蛋白质如皮肤胶原蛋白广泛被共价修饰从而加速了AGE的形成［3］。AGEs可通过多种病理机制参与糖尿病慢性并发症的发生和发展。而受体介导的途径是AGEs造成糖尿病慢性并发症和心血管疾病的主要机制。在几种不同的AGEs特异性受体中，研究最多、作用最明确的是RAGE。研究证实糖尿病动物的肾脏中检测出AGEs显著增加，给予正常小鼠AGE白蛋白后可以形成与糖尿病肾病相同的肾脏病变，而给予AGE形成抑制剂如氨基胍或RAGE特异性中和抗体则可以减轻这些改变。因此对AGE－RAGE途径的抑制已成为治疗糖尿病肾病的一个重要靶点［4，5］。本实验结果显示糖尿病组大鼠肾皮质中RAGE mRNA的表达比正常对照组明显增高，具有显著差异(p＜0．01)，这与国内外大量研究报道一致，进一步证实了糖尿病肾病的发生与RAGE所介导的组织损伤作用有关。

灯盏花素又名灯盏细辛，为菊科植物短葶飞蓬的全草，为一种植物药，其有效成分为二咖啡酰奎宁酸，焦炔康酸，原二茶酸等黄酮类化合物［6］。灯盏花素除了其扩张血管，降低血液黏度，增加血流量，改善局部供血，减少血小板计数及抑制血小板积聚等功能对DN的防治有作用外，目前的研究还发现它通过抑制氧化应激和增强机体的抗氧化作用来防治糖尿病肾病。本实验结果也显示糖尿病大鼠肾皮质的RAGE mRNA表达明显高于正常对照组(p＜0．01)，而用灯盏花素治疗糖尿病大鼠8周后，与未治疗的糖尿病大鼠相比RAGE mRNA的表达水平显著降低(p＜0.01)。本实验结果同时显示灯盏花素对糖尿病大鼠的血糖无影响。所以灯盏花素降低RAGE在肾皮质的表达作用是独立于降糖作用以外的，可能与其抑制氧化应激和增强机体的抗氧化作用，以及抑制血NF－κB及 TGF－β水平增加有关，为防治糖尿病肾病提供了新的方法。

1 Suzuki D，Toyoda M，Yamamoto N，et al．Relationship between the expression of advanced glycation end－products(AGE)and the receptor for AGE(RAGE)mRNA in diabetic nephropathy［J］．Intern Med，2006，45(7):435－441

2 马丽，朱邦豪，陈健文，等．灯盏花素对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响［J］．中国药理学通报，2004，20(9):1030－1033

3 Jian GS，Mei FY，Xiao CC，et al．Effects of puerarin on receptor for advanced glycation end products in nephridial tissue of streptozotocininduced diabetic rats［J］．Mol Biol Rep，2009，36(8):2229 －2233

4 Flyvbjerg A，Denner L，Schrijvers BF，et al．Long－term renal effects of a neutralizing RAGE antibody in obese type 2 diabetic mice［J］．Diabetes，2004，53:166－172

5 Chuang PY，Yu Q，Fang W，et al．Advanced glycation endproducts induce podocyte apoptosis by activation of the FOXO4 transcription factor［J］．Kidney Int，2007，72(8):965 －976

6 Wang M，Xie C，Cai RL，et al．Studies on antioxidant activities of breviscapine in the cell－ free system［J］．Am JChin Med，2008，36(6):1199－1207