人源化乙肝表面抗体重链克隆、表达及免疫学特性初步鉴定

王晔恺 周吉航 周世权 曾 芳 黄燕燕 刘晓光

血源性乙肝疫苗在我国经数十年近亿人次的接种，虽从总体来说具有良好的安全性和免疫原性，但对小部分使用者如新生儿等群体仍存在异源性致敏的风险［1］。随着DNA重组技术的进展，出现了鼠单抗、小分子抗体等各种重组乙肝表面抗体，但与天然的人抗体分子相比，小分子抗体结构不完整无法发挥Fc段介导的各种生物学效应，而鼠单抗则不能完全消除抗体的异源性，亲和力也低。因此，本研究针对以上的问题，通过流式分选得到抗体分泌细胞(antibody-secreting cells，ASC)群，建立起一种利用单细胞RT-PCR克隆并表达得到能与乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)特异性结合的人源化乙肝表面抗体(hepatitis B surface antibody，HB-sAb)重链，为人源化、个体化的乙肝治疗性抗体开发提供理论和实验依据。

对象与方法

1．研究对象:选取健康志愿者8名，无各种器质性和免疫性疾病史，未接种过乙肝疫苗，乙肝三系各项检测均为阴性(放射免疫法)，对志愿者注射乙肝疫苗(基础免疫3针)，完成第3针注射后的第30日清晨各志愿者均空腹抽血20ml，以枸橼酸钠(1∶9)抗凝，每份样本取2ml全血3000r/min离心取500μl血浆检测其HBsAb浓度(放射免疫法)，筛选得到HB-sAb＞1000mIU/ml的样本1份。

2．单细胞分选:将筛选出的HBsAb＞1000mIU/ml的血样(放免仪器为雅培i2000型，乙肝三系定量检测试剂盒为配套试剂)用 Ficoll液(CEDARLANE-H-CL5020)分离，吸取500μl单个核细胞层悬液，PBS洗涤3次，吸弃上清，加CD3-FITC、CD20-FITC、CD38-PE、CD27-PC5、CD19-APC 各 20 μl(贝克曼-库尔特)，振荡混匀，避光静置20min后，加200μl PBS，标本置流式细胞仪(BD FACSAria高速分选型)上，依次选取 R1→R2→R3门，得到 R1＆R2＆R3细胞群(CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high)，用调试用96孔板(Axygen公司)确定液滴中心位置，开启这群细胞的分选，每孔一个细胞，分选多板(图1)。分选结束后加盖并取出微孔板，显微镜(Olympus BX60)下计数并记录有单个细胞的孔号。

3．乙肝表面抗体重链克隆:单细胞RT-PCR模板制备:在显微镜下观察到有单个细胞的微孔中每孔加入1%的NP40(碧云天生物技术研究所)5μl，42℃孵育 20min，再加 AMV 0．5μl，45℃孵育45min，然后分两等份，分别用于重链部分全长片段和全长片段的克隆。

采用巢式PCR克隆重链部分全长片段:取单细胞RT-PCR模板，第1轮PCR加Access Quick Master mix(2×)(Promega 公司)12．5 μl，dNTPs(10mmol/L each)0．5μl，重链部分全长片段5'-随机引物(天根生化)和3'-外侧引物(5'-aaggtgtgcacgccgctggt-3')各 0．5μl(终浓度为 0．6μmol/L)，加ddH2O 补足 25μl，PCR 条件为 95℃ 15min;95℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，30 个循环;72℃ 10min;4℃ 5min。第 2 轮PCR加第一轮 PCR 产物 2μl为模板，2 ×PCR buffer12．5μl，重链部分片段5'-随机引物和3'-内侧引物(5'-cggttcggggaagtagtcct-3')各 1μl(终浓度为 0．6μmol/L)，PCR 条件均为:95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，35 个循环;72℃5min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳。

4．重链部分全长PCR产物纯化和鉴定:产物切割，用DNA胶回收纯化试剂盒(Promega公司)纯化，克隆到T载体，挑取20个白斑摇菌，送至中国科学院北京基因组研究所测序。

5．重链全长克隆:取“单细胞 RT-PCR 模板”5μl，重链全长引物 5'端引物(5'-atcagatctatggctagt gggaggtgggc-3')0．5μl(终浓度为 1μmol/L)，3'端引物 0．5μl(5'-atcaagctttcatttacccggagaca ggga-3')(终浓度为 1μmol/L)，10 × buffer 5μl，dNTP(25mmol/L)2μl，LA taq 0．5 μl，补 ddH2O 到 25μl。扩增条件为 95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，35 个循环;72℃10min，扩增产物经0．8%琼脂糖凝胶电泳。产物经胶回收后，双酶切克隆到pEGF-N1成为pEGFP-IgG(H)质粒，并送中国科学院北京基因组研究所测序验证。

6．pEGFP-IgG(H)转染:pEGFP-IgG(H)质粒经 LipofectAMINETM试剂盒(Life Technologies公司)转染到COS-7细胞，培养72h，取上清4000r/min离心10min，弃沉淀。

7．IgG(H)结合特异性验证:HBsAg(北京生物制品研究所)用1×SDS稀释到10μg/ml，用PCR仪煮沸10min变性，每孔10μl上样，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白(15%分离胶，5%浓缩胶)，转移至PVDF膜上(300mA，30min)，5%脱脂牛奶封闭非特异抗原2h，按照蛋白质marker切割PVDF膜，并分别加入1∶50稀释的上清，4℃过夜。PBS-T洗涤3次，每次10min。再分别加入1∶1000稀释的羊抗人 IgG-HRP(Santa Cruz)，室温震摇1h，PBS-T洗涤3次，每次15min。ECL系统显色，凝胶成像仪(BIO-RADUniversal HoodⅡ型)下摄片，采用Quaintity one分析软件进行条带分析。

8．IgG(H)亲和力检测:亲和力常数(ka)测定参照Batty饱和法［2］，将 HBsAg溶解在 5μg/ml的碳酸钠缓冲液中，室温包被在96孔板中过夜，PBS-T洗3次，将不同浓度IG(H)上清加到96孔板中，孵育1h，洗去后加HRP标记羊抗人IgG二抗，TMB显色试剂盒显色后置酶标仪450nm波长下读取数据。

结 果

1．重链部分全长PCR产物电泳:条带约在480bp左右，将其条带回收后克隆到T载体(图2)。

图2 重链部分全长电泳

2．重链部分全长序列分析:20个白斑摇菌所得的20个序列在NCBI数据库经Blast分析，15个克隆全长在600bp～1kb，剩下的5个克隆中有3个是序列相同的克隆，另外2个也是IgG重链的序列，本研究中我们只选取了相同序列的3个克隆进一步设计全长引物扩增其全长。

3．重链全长 PCR产物电泳和测序:条带约在1500bp左右，与预期长度相符，经测序分析重链全长基因ORF序列与NCBI数据库中的XP_002348298 95%同源，其Acession number为igg_heavy HQ829365(图3)。

图3 重链全长PCR产物电泳

4．IgG(H)结合特异性检测:Western blotting显示，pEGFP-N1上清液孵和pEGFP-N1上清液加入10μgHBsAg后孵育均无目的条带，而 pEGFP-IgG(H)上清液孵育有较强的条带，但pEGFP-IgG(H)上清液加入10μgHBsAg后条带灰度降低较大，这说明上清液中加入的HBsAg与4d上的HBsAg竞争性地结合上清中的重链，从而造成4d上的条带灰度降低(图4)。

讨 论

单克隆抗体自从20世纪70年代制备出来以后，在医学、生物学、免疫学等诸多学科发挥了重要作用，在临床上对于肿瘤等疾病也有一定的应用价值［3］，但治疗性单抗目前存在的主要问题是多以鼠源为主，容易被人体免疫系统识别产生人抗鼠抗体而将其清除［4］。因此，单抗的人源化改造成为热点，这是因为人源化改造后不但减少了机体的免疫排斥反应，而且人源化抗体中的Fc段能够诱发机体效应细胞的杀伤作用［5］。

目前完全人源化抗体的制备方法主要通过抗体库技术和转基因技术，而我们通过流式分选和单细胞RT-PCR建立的这种从外周血ASC细胞中扩增乙肝表面抗体重链基因的技术，不但达到了完全的人源化，而且从理论上说可以针对个体制备出个体化的抗体，达到个体化治疗的目的。由于ASC细胞目前的尚无共同认可的表面标记，Crotty等［6］认为人记忆性B细胞表面标记是CD19+CD20+Ig+CD27+，在受外界抗原刺激7天左右能达到外周血ASC细胞的2%左右，并通过酶联斑点免疫法分离得到这群细胞。而本研究则采用Smith K等［7］报道所采用的 CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high这类组合进行筛选ASC细胞。并且单细胞RT-PCR的优点在于克隆出来的重链和轻链和来源于同一ASC细胞，通过连接肽(Gly4Ser)3连接配对后，构建出来的抗体可以和自然分泌抗体的分子结构达到高度的相似性，从而最大程度地发挥抗体的结合能力，这是一般重组技术和多细胞模板的RT-PCR无法做到的。

抗体的免疫学特性主要体现于抗原抗体反应的结合容量、亲和力、特异性3方面，其中测定亲和力Ka的方法有平衡透析法、Scatchard plot法和Batty饱和法等［8］，由于Batty饱和法简单适用，因此本研究用了此法检测IgG(H)的Ka值达到了2．39×109L/mol，而根据 James等［9］Ka为 107～1012L/mol为高亲和力的理论，我们表达得到的IgG(H)亲和力较高。在对抗体的特异性鉴定中一般使用交叉反应实验，而本研究只通过设立多种对照初步地证明IgG(H)对HBsAg具有一定的结合力，提示此由此重链所制备得到的乙肝表面抗体非常可能具有清除乙肝病毒的能力，在职业暴露、产前阻断等个体化预防和治疗的应用领域有广泛的前景。

1 Bulbul A，Karadag A，Köklü E，et al．Anaphylactic shock due to hepatitis B immunoglobulin in a newborn［J］．Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine，2010，23(10):1257-1259

2 Batty JD，Beatty BG，Vlahos WG．Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay［J］．J Immunol Methods，1987，100(1-2):173-179

3 Arlen M，Arlen P，Tsang A，et al．The therapeutic value of monoclonal antibodies directed against immunogenic tumor glycoproteins［J］．J Cancer，2010，1:209-222

4 Goto M，Kuribayashi K，Umemori Y，et al．High prevalence of human anti-mouse antibodies in the serum of colorectal cancer patients［J］．Anticancer Res，2010，30(10):4353-4356

5 王业荣，童德文，李立，等．人源化抗体制备及其应用研究进展［J］．生物技术通讯，2007，18(4):683-687

6 Crotty S，Aubert RD，Glidewell J，et al．Tracking human antigen-specific memory B cells:a sensitive and generalized ELISPOTsystem［J］．J Immunol Methods，2004，286(1-2):111-122

7 Smith K，Garman L，Wrammert J，et al．Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen［J］．Nat Protoc，2009，4(3):372-384

8 王自良，张改平，杨艳艳，等．抗苯巴比妥单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定［J］．核农学报，2006，20(4):336-340

9 James WG．Monoclonal antibodies:principles and practice［M］．Academic press，Inc Ltd，1983:142-147