肠道微生物与新生儿坏死性小肠结肠炎

帅向华

新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿消化系统极为严重的疾病，有较高的发病率和病死率。临床上以腹胀、呕吐、腹泻、便血、严重者发生休克及多系统器官功能衰竭为主要临床表现，腹部X线检查以肠壁囊样积气为特征。有报道，NEC的发病率大概在2% ～5%之间［1］。随着新生儿学的发展，极低出生体重儿(VLBW)存活率不断提高，NEC的发病率还在上升。NEC的病死率在10% ～50%之间，重度NEC的病死率接近100%。存活的NEC患儿常有长期后遗症，包括肠管狭窄、短肠综合征、反复感染、体重不增和脑瘫等［2］。由于NEC病死率高，长期后遗症重，从根本明确该病的发病机制显得非常迫切与重要。

一、肠道微生物参与NEC发病的临床证据

目前NEC的病因及发病机制尚未完全明确，一般认为是多因素综合作用所致，包括低胎龄、低出生体重、低Apgar评分、透明膜病、配方奶喂养、脐静脉插管和肠道缺血等［3］，导致肠黏膜屏障功能不全或受损、细菌在肠腔内过度繁殖并产生大量炎性介质，最终导致肠壁损伤甚至坏死、穿孔和全身炎症反应(SIRS)甚至休克、多器官衰竭。有数据显示，预防性口服万古霉素或庆大霉素可以减少NEC的发生率［4］。广谱抗生素治疗NEC及微生态制剂在临床上应用取得的良好效果，提示控制肠道微生物可以影响NEC患儿的预后［5］。从晚期NEC患儿的血、腹腔积液和大便中能分离出肠道细菌，包括大肠杆菌属、肠杆菌属、克雷伯杆菌属等，偶有凝固酶阴性的葡萄球菌属［6］。这些感染可能是由于细菌移位，即肠道原籍菌通过不成熟、受损的肠黏膜引起的。因此有学者推测，肠道微生物在NEC发病机制中起重要的作用。

二、肠道微生物参与NEC发病的作用机制

1．肠道微生物构成肠黏膜的部分屏障功能:肠黏膜具有阻止病原微生物和抗原进入体循环的屏障功能，包括外屏障功能和内屏障功能［7］。胃酸、肠蠕动、黏液层、分泌型免疫球蛋白A及正常肠道菌群等构成了肠黏膜的外屏障功能，它抑制了病原微生物在肠道内的定植和在肠上皮细胞上的黏附［8］。肠上皮细胞的半透膜和细胞间的紧密连接(TJs)等构成了肠黏膜的内屏障功能，又称为细胞防御机制，它能阻止病原微生物通过和限制大分子物质的弥散［9］。保持肠黏膜屏障功能的完整，才能保护机体免受病原微生物的侵害。

新生儿出生后就有细菌在肠道内定植。新生儿和成人比较，肠道菌群有很大的不同。在新生儿，原籍菌在黏膜表面和肠腔内的定植有一种特殊的方式，即所谓的“连续过程(succession)”［10］。它可分为 4个期，第Ⅰ期，也就是最初获得期，从出生至生后2周，在这一期，链球菌和大肠杆菌在肠道内占绝对优势，革兰阳性菌、无芽孢厌氧菌开始出现，包括母乳喂养的新生儿以双歧杆菌占优势，配方奶喂养的新生儿以乳杆菌占优势，梭状芽胞杆菌和类杆菌属也能发现，但数量较少。第Ⅱ期发生于第Ⅰ期结束至开始消化固体食物之前，在这一期内，类杆菌属数量逐渐增加。第Ⅲ期发生于开始添加辅食至彻底断母乳之前，这一期一直持续到肠道菌群与成人相似(第Ⅳ期)。肠道原籍菌、特别是厌氧菌，抑制了大肠菌的数量，使他们处于相对低的水平。实际上，细菌定植是NEC发病的前提条件［11］。在第Ⅰ期由于厌氧菌相对缺乏，使得病原微生物非常容易在新生儿消化道内定植，从而促成了NEC的发病，所以在临床上，NEC通常在生后2周左右发病。有研究显示，共生菌不仅能调控某种保护基因的表达［12］，而且还能产生有毒物质对抗需氧菌、竞争占位效应、降低肠腔内pH值等，从而削弱病原微生物的黏附力，保护宿主。因此，正常的肠道菌群在整体上维持肠黏膜的屏障功能发挥了重要作用。

2．细菌在NEC发病中的分子学作用机制:病原微生物通过表面的病原体相关分子模式(PAMPs)与肠道的免疫系统发生相互作用。病原体相关分子模式是众多微生物共有的一种保守的模式分子，它广泛存在于病原体细胞表面，如脂多糖(LPS)、糖脂、鞭毛蛋白和核酸等。能识别PAMPs的受体称为模式识别受体(pattern recognitionreceptor，PRRs)，它们与细菌PAMPs的相互作用，对保持肠壁完整性起关键作用。Toll－like受体(TLRs)是一个非常好的模式识别受体(PRRs)，至今已发现TLRs家族中的TLR1～10，其中，TLR－4已被广泛研究，体内与体外的NEC动物试验研究，都证实LPS通过TLR－4结合进行信号传递，促进细胞凋亡，导致 NEC症状的出现。Leaphart等［13］研究显示 TLR－4增加了小鼠患 NEC的风险，从而证实了TLR－4信号的重要性。Caplan等［14］研究显示母乳喂养动物的肠上皮细胞上的TLR－4表达短暂下降，试验动物的NEC发病率明显下降。在NEC小鼠试验中，LPS浓度不仅在动物血浆中，而且在大便样本中都有升高［15］。与这些研究结果一致，LPS浓度在NEC患儿血浆中也明显升高。因此LPS通过与TLR－4结合进行信号传递是NEC发病机制中的重要分子学机制。

三、阪崎肠杆菌与NEC暴发

阪崎肠杆菌(enterobacter sakazakii，ES)是一种少见的微生物，它是革兰染色阴性、无芽胞杆菌，以前被称为黄色阴沟肠杆菌(yellow－pigmented Enterobacter cloacae)，1980年重新归类为一种独立的菌群。阪崎肠杆菌高度耐热，并能耐受渗透压和干燥，因此能在干燥的配方奶粉中存活。阪崎肠杆菌高度有毒，从0．36到66菌落形成单位/100克就足以引起疾病［16］。阪崎肠杆菌与新生儿脓毒症和脑膜炎有关，也与NEC的暴发有关。Van Acker等［17］曾报道，在NICU中的12例NEC患儿，ES是NEC暴发的病因。其中2例由于ES感染而死亡，并证实这些病例直接与使用被ES污染的配方奶粉有关，因此作者推荐在NICU中使用灭菌的液体牛奶来防止由于ES引起的NEC暴发。另外一个ES暴发发生在美国的孟菲斯市，包括4个新生儿，其中3个有脓毒症和NEC相关的血样便腹泻，4个病例中培养出具有相同质粒的ES，且追踪到患儿曾使用同一罐奶粉［18］。这些报道均说明，细菌在NEC发病机制中发挥重要作用。绝大部分病原体通过有毒因子与特殊受体结合发挥对宿主的影响，如靶细胞表面的TLRs。通过NEC动物模型研究，细菌黏附肠上皮是ES入侵肠黏膜的第一步。Hunter等显示ES与小肠上皮细胞(IEC－6细胞)结合，导致小鼠上皮细胞凋亡，并引起炎症因子上调，如IL－6等，从而引起试验小鼠的NEC临床表现和形态学改变［19］。这种现象，在小鼠肠上皮细胞的体外试验中得到同样的结果。因此可以证实，异常的细菌定植改变肠上皮细胞炎症信号，从而影响肠上皮修复及肠上皮细胞增殖，最终导致临床NEC．。

四、微生态制剂在治疗和预防NEC中的作用

根据世界卫生组织，微生态制剂是“活的微生物，当给予足够的数量时，对宿主的健康有利”［20］。应用生态制剂主要是通过这些共生菌使婴儿胃肠道菌群正常化。这些保护性的细菌属包括双歧杆菌和乳杆菌。最常用的生态制剂包括多种类型的双歧杆菌属(bifidobacterium)，比如短双歧杆菌(B．breve)和乳双歧杆菌(B．lactis)，乳杆菌属(lactobacillus)，如嗜酸乳杆菌(L．acidophilus)和干酪乳杆菌(L．casei)，链球菌属(streptococcus)，如唾液链球菌(S．salivaris)等［21］。

双歧杆菌属是最常用的微生态制剂，他们中的长双歧杆菌(B．longum)和两歧双歧杆菌(B．bifidum)通常发现于婴儿时期的肠内。也是母乳喂养的婴儿肠腔内能检测到的最普遍的微生物。多种类型的双歧杆菌对人体有益，比如刺激肠道淋巴组织分泌保护性因子，并抵抗病原微生物的定植。有些种属的双歧杆菌如动物双歧杆菌(B．animalis)和乳双歧杆菌被应用于奶制品、食物添加剂和药物制剂中。微生态制剂对肠黏膜的保护作用，其机制还没有被完全阐明，研究表明，应用微生态制剂能保护早产儿肠道。一项有关微生态制剂在NEC中的应用的多中心回顾性研究，包括近1500个新生儿，结果显示肠道内补充微生态制剂可以减少发生严重NEC的风险和早产儿的病死率。到目前为止，有4个关于在NICU患者中预防性使用微生态制剂的随机对照研究。Hoyos等在1999年应用嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)于NICU患儿中可以减少NEC的发病率和NEC相关的病死率，而没有不良反应。Bin－Nun等将婴儿双歧杆菌应用于145个VLBW新生儿，结果显示研究组NEC的发病率和NEC相关的死亡病例低于对照组，然而，脓毒症的发生率和抗生素的应用时间在研究组和对照组没有区别。为了更好地阐明微生态制剂在NEC中发挥保护性作用的机制，许多的动物研究正在进行当中。曾有研究显示，给暴露于组织缺氧、配方奶喂养的新生小鼠口服婴儿双歧杆菌，结果显示对肠道炎症反应有保护作用。最近的动物试验研究显示，预防性应用保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)可以抑制细胞因子的上调，减少ES导致的细胞凋亡，进一步推测，应用保加利亚乳杆菌可以保护被ES污染配方奶喂养的幼鼠发展成NEC，因此生态制剂可能成为一种减少新生儿发生NEC发病率的一种预防性治疗方法。

总之，NES是多因素作用的结果，病因复杂，最终通过肠黏膜屏障功能受损、从而细菌繁殖、入侵，释放大量炎性介质，导致NEC发病。人类胃肠道的微生态极其复杂，但随着高通量(high－throughput)技术的进步，肠道微生物促成NEC的发病机制研究将会有新的发现。由于新生儿肠道内微生物缺乏多样性，且容易控制，应用宏基因组(metagenomics)等高通量技术研究新生儿肠道微生态，对有NEC高风险的极低出生体重儿(VLBW)的存活和预后有重大意义。将来更多的治疗方法和预防策略将从NEC的发病机制上进一步探索。

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