脂联素基因多态性与2型糖尿病肾病的关系

彭春玲 洪郁芝 傅莉萍

糖尿病肾病(DN)是糖尿病主要的微血管并发症之一。据文献报道，病程超过25年的1型及2型糖尿病患者中糖尿病肾病的累积患病率高达25%～40%，已经成为欧美国家终末期肾病的最主要原因。在我国，它是导致终末期肾功能衰竭的第2位病因。因此，研究DN的发病机制，并在此基础上探索防治DN的有效途径已成为我们的迫切任务。人类脂联素基因是单拷贝基因，位于染色体3q27，此区域存在2型糖尿病易感位点，而且有较大频率的基因多态性。本研究旨在通过对脂联素SNP+45和SNP+276位点上的基因型和等位基因频率的分析，来探讨脂联素参与糖尿病肾病的遗传机制。

资料与方法

1．研究对象:从2009年4～12月在浙江中医药大学附属广兴医院内分泌代谢科和肾病科住院的2型糖尿病病史在5年以上的患者中筛选82例，均为浙江地区汉族人，彼此间无血缘关系。其诊断和分型均符合2007年CDS《中国2型糖尿病防治指南》制订的标准，根据尿白蛋白排泄率(UAER)分为3组:＜30mg/24h为正常白蛋白尿组(40例)，男性24例，女性16例;30～300mg/24h为微量白蛋白尿组(25例)，男性15例，女性10例;＞300mg/24h为大量白蛋白尿组(17例)，男性10例，女性7例。入选患者排除血糖控制不稳定、肾功能不全、心肺功能不全、发热、感染，排除原发性肾脏疾病和其他继发性肾脏疾病，近2周内未服用ACEI或ARB类药物。

2．研究方法:(1)生化指标及临床资料:所有研究对象在隔夜禁食10～12h后于次日清晨6:00抽取静脉血6ml，3ml置于普通试管中，送生化室检测各项生化指标。3ml置于含有EDTA抗凝剂的试管中，3000r/min离心15min取血细胞部分，分装冻存于－70℃冰箱中，待标本收齐后统一进行检测。留取24h尿液标本，用浓盐酸防腐，取部分尿液测定尿白蛋白排泄率。

(2)脂联素基因多态位点+45T/G与+276G/T基因型的检测:取出－70℃冰箱冻存的血细胞，常温解冻，按照人血液基因组DNA提取试剂盒(DV811A)(日本TaKaRa公司)说明提取外周血DNA，再行1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用BIO－RAD凝胶成像系统照相记录，见图1。以提取出的基因组DNA为模板在50μl反应体系内进行聚合酶链反应(PCR)。引物设计参考文献，宝生物工程(大连)有限公司合成［1］。上游引物:5'－GATGGACGGAGTCCTTTGTAGGTC－ 3'，下游引物:5'－CCAAATCACTTCAGGTTGCTTATG－3'。反应体系:10 × Buffer 5μl，MgCl2(25mmol/L)3μl，dNTP(各 2．5mmol/L)4μl，上游引物(10pmol/μl)2μl，下游引物(10pmol/μl)2μl，基因组 DNA 4μl，Taq 酶(5U/μl)0．6μl，ddH2O29．4μl。反应条件:预变性 95℃ 5min，变性 95℃ 30s，退火 59．5℃ 30s，延伸72℃ 30s，末端延伸72℃ 10min，4℃保存，共35循环。扩增产物452bp。PCR反应结束后，取10μl产物与2μl的6×Loading Buffer混合，加样于1%琼脂糖凝胶电泳中进行检测，用BIORAD凝胶成像系统照相记录，见图2。余PCR产物送上海美季生物技术公司进行纯化后测序。

3．统计学方法:采用SPSS 17．0医学统计软件分析数据，各组间基因型分布和等位基因频率比较用χ2检验，各基因型观测指标的比较用方差分析，p＜0．05有统计学意义。

图1 人血液中提取的基因组DNA

结 果

图2 脂联素基因的PCR扩增片段(452bp)

1．各组间的一般临床资料及生化指标比较:各组年龄、性别构成比无明显差异，BMI、DBP、血糖、HbA1c、TG、TC 、HDL、LDL 组间比较无统计学意义(P均＞0．05)。SBP在大量白蛋白尿组和微量白蛋白尿组均高于正常白蛋白尿组(p＜0．01，p＜0．05)。尿白蛋白排泄率在大量白蛋白尿组显著高于微量白蛋白尿组和正常白蛋白尿组(p＜0．01)。Ccr在大量白蛋白尿组和微量白蛋白尿组均显著低于正常白蛋白尿组(p＜0．01)。Scr在大量白蛋白尿组和微量白蛋白尿组均高于正常白蛋白尿组(p＜0.05)，见表 1。

表1 各组临床、生化指标的比较

表1 各组临床、生化指标的比较

与正常组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;与微量蛋白尿组比较，#p＜0．01

正常10/7 15/10 24/16年龄(岁) 63．65 ±13．67 61．52 ±11．68 59．70 ±10．22 BMI(kg/m2) 23．93 ±2．79 23．85 ±4．67 23．24 ±2．89 SBP(mmHg) 143 ±13．96＊＊ 137．92 ±18．60*129．55 ±14．28 DBP(mmHg) 80．12 ±10．69 75．32 ±8．82 75．35 ±9．87血糖(mmol/L) 8．15 ±3．42 7．55 ±2．62 7．25 ±2．81 HbA1c(%) 8．51 ±1．77 9．16 ±2．17 8．79 ±2．35 TG(mmol/L) 1．43 ±0．77 1．73 ±0．74 1．82 ±1．04 TC(mmol/L) 4．60 ±0．99 4．87 ±0．90 4．77 ±1．15 HDL(mmol/L) 1．07 ±0．34 1．07 ±0．31 1．07 ±0．26 LDL(mmol/L) 2．65 ±0．82 2．78 ±0．67 2．64 ±0．88白蛋白尿组性别(男性/女性)项目 大量白蛋白尿组微量白蛋白尿组68．30 ±19．39尿白蛋白排泄率(mg/24h) 1562．78 ±1615．15＊＊#86．28 ±48．04 10．46 ±5．60 Ccr(ml/min) 76．24 ±42．92＊＊ 77．95 ±29．76＊＊ 114．11 ±53．21 Scr(μmol/L) 91．00 ±32．07* 87．2 ±47．41*

2．各组基因型和等位基因频率的比较:大量白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和正常白蛋白尿组比较，ANP+45位点基因型和等位基因频率的差异无统计学意义(P均＞0．05)。ANP+276位点基因型和等位基因频率的差异无统计学意义(P均＞0．05)。见表2、表3。

表2 脂联素+45位各组基因型和等位基因的比较

表3 脂联素+276位各组基因型和等位基因的比较

3．各脂联素基因型观测指标的比较:(1)所有研究对象中，脂联素各基因型观测指标的比较:脂联素SNP+45位点的TT、TG、GG 3组基因型的所有观测指标比较，BMI具有统计学意义(p＜0．05)，TT型与TG型比较有显著差异(p＜0．01)，余指标的比较无统计学意义(P均＞0．05)。脂联素SNP+276位点的TT、TG、GG 3组基因型的所有观测指标比较，无统计学意义(P均＞0．05)。(2)3组中脂联素基因型观测指标的比较:脂联素SNP+45位点，正常白蛋白尿组中，TT与TG型比较，Scr的差异有统计学意义(p＜0．01);余组中3种基因型的所有指标比较无统计学意义(P均＞0．05)。脂联素SNP+276位点，大量白蛋白尿组中，TG与GG型比较，DBP的差异有统计学意义(p＜0．05);微量白蛋白尿组中，TG、GG与TT型比较，尿白蛋白的差异具有统计学意义(P均＜0.01)。

讨 论

2型糖尿病肾病是由遗传和环境因素共同作用的一种多基因疾病，其发生有较大的种族差异。糖尿病肾病的发病机制尚未完全明确，近年来国内外学者从各方面进行了大量的研究，遗传因素被认为是其发生的危险因素之一。流行病学资料显示，糖尿病肾病有家族聚集性，此可能与某些基因的突变或多态性变化有关。脂联素作为一种新型的由脂肪细胞特异性分泌的蛋白质，与2型糖尿病肾病相关。其基因的多态性调控着脂联素的表达，影响其血清脂联素水平以及向糖尿病肾病的发生发展。

人类脂联素基因(APM－1)位于染色体3q27区域，包括3个外显子和2个内含子，此区域存在2型糖尿病、代谢综合征的易感位点，而且有较大频率的基因多态性，通过对人类脂联素基因全序列分析发现，正常人脂联素基因序列中存在相当数量的等位基因单核苷酸多态性，但是密码子变化并不改变构成蛋白质的氨基酸序列。目前国内外对定位于染色体3q27区域的人脂联素基因的单核苷酸多态性与疾病的关系做了大量研究，发现不同人群其多态性与疾病的相关性不尽相同，这说明在不同的人群中，脂联素基因的SNPs可能与遗传和环境等因素有关。

目前己发现17个脂联素基因的遗传变异，如外显子2上45位点和内含子2上276位点T/G多态性，－11426位点G/A多态性等都是常见的单核普酸多态性。此外，还存在许多稀有突变。既往研究表明SNP+45T/G属于同义突变Gly15Gly，由于位置靠近外显子和内含子的连接部位，故这一编码区的静止突变可能是通过影响mRNA的剪切机制来影响脂联素基因的表达［4］。而SNP+276G/T则远离剪切位点，其调节RNA水平的机制尚不清楚，可能是与不同等位基因造成的不同寡核苷酸转录文本与转录因子的亲和力不同有关。有文献报道SNP+45T/G和SNP+276G/T与脂联素基因启动子区域的SNP－11391和SNP－11377多态性位点呈连锁不平衡，因此这两个位点的基因多态性可能对基因的启动子区域造成影响而发挥作用［5］。

多项研究表明，脂联素基因外显子2和内含子2的SNP+45T/G及SNP+276G/T多态性与2型糖尿病和胰岛素抵抗明显相关。但国内外关于脂联素SNP+45T/G和+276位G/T的变异与2型糖尿病肾病的相关性研究并不多，而且研究结果也不尽一致。

本实验研究结果显示，脂联素SNP+45T/G和+276位G/T的变异和等位基因的频率在2型糖尿病肾病大量白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和正常白蛋白尿组的差异无统计学意义(P均＞0．05)，说明这两个位点的基因型和等位基因频率的变异与2型糖尿病肾病无相关性，与 Yoshioka 等［6］、郭志新等［7］的研究结果一致。Bostrom等［8］发现瑞典人群中此两位点的变异与1型糖尿病肾病不相关。然而，国内外亦有研究发现脂联素的SNPs与2型糖尿病肾病相关。研究结果不一致的原因可能是不同的种族和地域，以及不同环境因素的影响;与我们采用的是西方人群SNPs数据库也有关。此外，本研究由于样本例数不多也会对结果造成一定的影响，因此，还必须增加样本量，扩大研究地域的范围，这样才有助于我们判断脂联素基因是否为中国人群2型糖尿病肾病的易感基因，

本研究还发现，脂联素SNP+45位点，TT与TG基因型比较，BMI具有统计学差异(p＜0．05)，说明此两种基因型可能对BMI有影响。脂联素SNP+45T/G和SNP+276G/T与2型糖尿病肾病的发生无相关性，此两位点的多态性并不能预测2型糖尿病肾病的易感性。

1 劳力敏，向红丁．脂联素基因多态性与妊娠糖尿病的相关性［J］．中国全科医学，2008，11(9B):1640 －1642

2 Cartegni L，Chew SL，Krainer AR．Listening to silence and understanding nonsense:exonic mutations that affect sp licing［J］．Nat Rev-Genet，2002，3(4):285 －298

3 Vasseur F，Helbecque N，Dina C，et al．Single － nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM1 gene modulate adipocyte－secreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians［J］．Hum Mol Genet，2002，11:2607 －2614

4 Yoshioka K，Yoshida T，Umekawa T，et al．Adiponectin gene polymorphism G276T is not associated with incipient diabetic nephropathy in Japanese type 2 diabetic patients［J］．Metabolism，2004，53(9):1223－1226

5 郭志新，吴苏豫．脂联素基因276位点多态性与2型糖尿病肾病的关系［J］．山西医科大学学报，2008，39(6):507 －510

6 Ma J，Mollsten A，Falhammar H，et al．Genetic association analysis of the adiponectin polymorphisms in type 1 diabetes with and without diabetic nephropathy［J］．Diabetes Complications，2007，21(1):28 － 33

7 Wu LS，Hsieh CH，Pei D，et al．Association and interaction analyses of genetic variants in ADIPOQ，ENPP1，GHSR，PPAR{gamma}and TCF7L2 genes for diabetic nephropathy in a Taiwanese population with type 2 diabetes［J］．Nephrol Dial Transplant，2009，24(11):3360 －3366

8 Bostrom MA，Freedman BI，Langefeld CD，et al．Association of adiponectin gene polymorphisms with type 2 diabetes in an African American population enriched for nephropathy［J］．Diabetes，2009，58(2):499 －504