磷酸二酯酶4D基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中的关系

王汉旻 陈晓丽 叶好好 毕 涌 潘东波 徐丽英 吴建波 黄海波

目前脑卒中已成为我国首位的致残和死亡原因，其中约70%为缺血性脑卒中。缺血性卒中是环境和遗传因素共同导致的复杂疾病。冰岛deCODE研究组发现，在冰岛人群中磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)基因是大动脉和心源性缺血性卒中的一种新的危险因素，如能在其他人种中证实这个结论，将有助于卒中预防和治疗［1］。之后在不同的种族，进行了很多相关研究，但结果很不一致［2～6］。为验证PDE4D基因与缺血性卒中相关性，笔者选择冰岛deCODE研究组结果中PDE4D基因与卒中关系最强的2个位点，即SNP83、32;研究浙南地区汉族人群中PDE4D基因与动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中(atherothrombosis ischemic stroke，AIS)的关系。

对象与方法

1．研究对象:(1)病例组:收集2006年4月～2009年6月期间在温州医学院附属第一医院脑血管科或神经内科病房住院的AIS患者235例(其中男性148例，女性87例)。患者年龄41～90岁，平均年龄61．31±10．11岁。(2)无卒中病史的对照组:系同期来笔者医院体检者，共105例(其中男性60例、女性45例)，均行神经查体、头颅MRI/A及血管超声检查，排除既往卒中、TIA、血管狭窄。年龄41～84岁，平均年龄60．04±9．41岁。两组均为浙南地区汉族人，无血缘关系，无迁移家史。两组研究人群的临床资料见表1。(3)入选标准:①脑血管检查(DSA/CTA/MRA/血管超声)证实颅内外动脉存在狭窄≥50%或闭塞;②有与病变侧血管供血区明确相关的临床症状和体征;③发病后DWI证实存在病变侧血管供血区新发生的脑梗死;④患者存在脑血管动脉粥样硬化的危险因素。(4)排除标准:①存在心源性栓子来源，如心脏瓣膜病变、心律失常、急性心肌梗死等;②其他非动脉粥样硬化性颈动脉病变，如颈动脉夹层、血管炎等;③存在其他可能导致脑梗死的因素，如红细胞增多征、系统性红斑狼疮等。

2．血标本生化检测和临床资料收集:抽取空腹血标本，在笔者医院检验科利用自动生化仪，常规检测血脂、血糖、血电解质、肝肾功能等项目。并且详细询问病史，包括高血压、糖尿病、烟酒史等。按照WHO标准，SBP＞140mmHg和(或)DBP＞90mmHg诊断为高血压。

3．实验方法:采用DNA fast2000试剂盒(上海博迈生物技术有限公司)从全血中抽提基因组DNA。SNP32位点序列上游引物:5'－GCTAAATGATGAGTTAATGG－3'，下游引物:5'－CATAGCAAGAACCTGACC－3'。SNP83位点序列上游引物:上游引物:5'－TTGTTTCTAGTGTTAGCCTTG －3'，下游引物:5'－ATTTGGCCTTGCAATATAC－3'。以 200ngDNA为模板，在25μl体系内进行 PCR扩增(AB1．9700PCR仪)。先95℃变性2min，然后进入循环，循环条件是 94℃ 30s，62．5℃30s，72℃ 30s，一共进行43个循环，循环结束后，72℃延伸反应5min。取扩增产物5μl于15μl酶切反应体系中进行酶切，内切酶分别为Msp AⅡ和MaeⅡ(分别购自NEB、Fermentas公司)。经1．5%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶图像分析系统下分析基因型。SNP32缺乏相应酶切位点为A型(305bp 1条带)，存在相应酶切位点为G型(96bp、209bp，2条带);SNP83缺乏相应酶切位点为T型(492bp，1条带)，存在相应酶切位点为C型(288bp、204bp，2 条带)。

4．统计学方法:所有数据统计均由SPSS16．0统计软件包完成。等位基因计数采用直接计数法，并计算基因型频率。基因型频率的分布经Hardy－Weinberg平衡检验，当P＞0．05时，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一蒙德尔群体。计量资料比较采用t检验，病例组与对照组间不同基因型及等位基因分布频率比较采用χ2检验，多因素分析采用Logistic回归。以p＜0．05为有统计学差异。

结 果

1．病例组和对照组临床资料的比较:病例组和对照组在年龄、性别、高血压、吸烟、饮酒、TC、LDL－C、TG等方面无明显差异;病例组糖尿病患者比例明显高于对照组(p＜0．01);且病例组HDL－C明显低于对照组(P ＜0．01)，详见表1。

2．PDE4D基因SNP83在两组中频率分布:电泳图片见图1。PDE4D基因SNP83在病例组和对照组中的分布均符合Hardy－Weinberg定律。病例组C等位基因频率(24．26%)高于对照组(15.71%)(P=0.012;OR=1．718;95%CI:1．120 ～2．633)详见表2。3种不同基因型之间存在统计学差异，P=0．044;进一步利用优势模型分析，病例组CC+CT基因型明显高于对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)，(OR=1．875;95%CI:1．137 ～3．092);调整糖尿病、HDL－C等危险因素后，差异仍存在(OR=2．023;95%CI:1．207 ～3．391)。

图1 PDE4D基因SNP83多态性PCR－RFLP结果

表2 SNP83位点基因型和等位基因在两组中的分布频率及与卒中相关性［n(%)］

3．PDE4D基因SNP32在两组中频率分布:电泳图片见图2。PDE4D基因SNP32在两组中的分布均符合Hardy－Weinberg定律。SNP32等位基因频率在两组相比，差异无统计学意义(P＞0．05)，详见表3。

图2 PDE4D基因SNP32多态性PCR－RFLP结果

表3 PDE4D基因SNP32在两组中频率分布［n(%)］

讨 论

本研究结果表明病例组PDE4D基因SNP83C等位基因频率明显高于对照组，且差异有统计学意义，说明C等位基因为AIS的致病风险基因;进一步利用优势模型分析，病例组CC+CT基因型明显高于对照组，差异也有统计学意义，CC或CT基因型发病概率为TT型的2倍;结果提示SNP83是AIS的遗传危险因素。我们的结果与deCODE研究组结论一致［1］。在巴基斯坦人、澳大利亚人群中，也同样发现SNP83与缺血性卒中相关［7，8］。Sun 等［9～11］人分别在中国不同地区汉族人群中证实了SNP83是缺血性卒中，尤其是AIS的遗传危险因子。然而在日本人群中却未发现这种相关性，这可能与研究群体差异及缺血性卒中本身是多因素疾病等有关［5］。我们的研究结论同中国几位学者结果完全一致，更加支持PDE4D(SNP83)基因是中国汉族人群AIS的致病基因。但本研究未发现SNP32与卒中的相关性，这同Brophy等［2，7］人研究结果一致，提示SNP32位点可能仅在冰岛特定人群中与卒中有关。

PDE4D基因位于人类染色体5q12上，全长约1.6Mb，含有24个外显子。该基因的蛋白产物有9种异构体。PDE4D在体内广泛表达，分布于各种炎性细胞内，包括肥大细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等［12］;同时在血管及神经元中亦有表达。PDE4D基因编码的PDE4D能特异性水解细胞内环磷酸腺苷(cAMP)，cAMP浓度主要由PDE4D的活性决定。在动脉粥样硬化形成过程中，cAMP起着关键作用，它具有多种生物学作用，参与调控哺乳类动物的血小板聚集、血管细胞的增殖和移行、免疫反应等。体外和在体试验均证实，高浓度的cAMP可抑制血管平滑肌细胞的增殖和移行;抑制炎症反应和血小板活化，减轻动脉粥样硬化程度。推测PDE4D通过影响细胞内cAMP水平参与动脉粥样硬化进程，进而影响卒中的发生。

颈动脉中内膜增厚和斑块代表动脉粥样硬化不同病程，能独立预测血管事件的发生［13］。英国有项研究表明PDE4D基因与颈动脉中内膜厚度和斑块无相关性，提示该基因不是通过动脉粥样硬化机制发挥作用［6］。然而，台湾学者发现对于男性患者，PDE4D基因与颈总动脉动脉中内膜厚度及斑块相关，而且进一步分析发现该基因对斑块的影响远甚于中内膜厚度，表明该基因参与动脉粥样硬化的形成。虽然临床证据关于PDE4D基因与动脉粥样硬化的关系结果不甚一致，但基础研究发现抑制PDE4D基因表达，可以阻止鼠主动脉平滑肌细胞增殖和迁移，支持PDE4D基因是致动脉粥样硬化因素。临床研究的结果不一致可能与实验设计差别、样本量小、不同人种等因素有关。

PDE4D在神经元中含量也和血管中一样丰富［18］。有研究报道cAMP，PDE4D的作用底物，在神经元存活和神经发生中具有一定作用。PDE4D敲除鼠和特异性PDE4D抑制剂，均可通过升高cAMP含量，增强记忆力、促进海马区神经发生。这些研究表明PDE4D基因可能还有神经元保护机制。

总之，本研究为PDE4D基因SNP83是中国汉族人群AIS的一个危险基因提供了新证据。目前实验证据虽不太一致，但学者们普遍认为PDE4D基因既参与动脉粥样硬化进程，又具有神经保护作用。未来尚需进一步研究该基因与卒中相关的确切机制，及将基因筛查应用于临床实践和发展有效的神经保护剂，以便能检出高危人群，有利于卒中的预防和治疗。

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