家蚕脂肪体细胞核蛋白的提取

山西 朱虹

细胞核蛋白是指在细胞质内合成,然后运输到核内起作用的一类蛋白质。核蛋白的研究在动、植物病害的防治及临床医学上有十分重要意义。在核蛋白提取的过程中，为了防止蛋白质降解和损耗，提取的步骤越少越好。我们使用各种不同的方法来摸索细胞核抽提实验的最佳方法和条件。最后我们根据2004年清华大学出版社出版，由刘进元翻译的《转录因子实用技术》一书，优化HeLa细胞核提取物的制备的方法，制备家蚕细胞核提取物。由于家蚕在5龄3天时期体内蛋白量表达最高，所以我们选择这个时期的家蚕幼虫作为材料提取细胞核蛋白。

一、家蚕脂肪体细胞核蛋白抽提方法的建立

1.实验材料

家蚕基因库5龄3天大造蚕品种雄性脂肪体。

2.所用试剂

3.所用仪器

（1）20mLDounce带较松研钵的玻璃匀浆器

（2）截留分子质量为12000～14000Da的透析袋

（3）透析夹

4.实验方法

（1）取家蚕5龄3天脂肪体，加入5倍体积的缓冲液A，用匀浆器匀浆30-40下，5000 rpm离心10min。

（2）冰育10min,5000 rpm离心10min。

（3）弃去上清，用3倍体积的缓冲液A重悬浮，用匀浆器匀浆20下左右。5000 rpm离心10min以沉降细胞核。

（4）取出上清（细胞质蛋白），重悬沉降细胞核于1mL缓冲液C中，测量总体积，加NaCl至终浓度300mmol/L，采用上下颠倒方式充分混合。

（5）冰浴30min，在4℃下以15000 rpm离心20min。

（6）用500mL缓冲液C透析，第一次透析过夜，第二次透析4 h。冷冻干燥后稀释，把溶液分装，取一管用Bradford方法测定蛋白浓度,其他于-80℃储存备用。

二、家蚕脂肪体细胞核蛋白的检测

（一）Brad ford方法测定蛋白浓度

1.所用试剂：

试剂A：考马斯亮蓝G-250原液（称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%的乙醇，加入100mL 85%（W/V）磷酸。

试剂B：0.01%考马斯亮蓝G-250测定工作液（将考马斯亮蓝G-250原液与双蒸水按15：85比例混匀，过滤，4℃，棕色瓶保存）

0.1 N盐酸和双蒸水（新鲜制备）

蛋白标准液：5mg/mL卵清蛋白溶液（将5mg卵清蛋白标准品溶于1 mL待测样品的溶剂体系，室温稳定2 h或者2-4℃过夜，12000g离心10 min后小量分装，-20℃保存6-8月，-80℃保存1年）

稀释液：待测样品的溶剂，小量分装，-20℃保存。

2.标准曲线的测定

（1）准备：将蛋白标准液，稀释液取出溶解；考马斯亮蓝G-250测定工作液取出恢复室温；根据测定用量新鲜准备0.1N盐酸和双蒸水。

（2）将9支干燥洁净的试管编号，按表1加入试剂，摇匀，室温放置半分钟后各管加入3.5mL考马斯亮蓝G-250测定工作液，摇匀，室温放置5 min后，以0号试管为空白调零测定其余各管595 nm处相对吸光度。

表1 标准曲线测定体系Table1 standard curve testing system

3.样品的测定

（1）在一干燥洁净试管内，先加入80μl双蒸水，再加入用稀释液调整蛋白浓度到测范围的样品10μl，加入0.1N盐酸10μl混匀半分钟后，加入3.5mL考马斯亮蓝G-250测定工作液，摇匀，室温放置5min后测定其在595 nm处相对吸光度。

（2）同（1）操作，测定两个平行样，取其平均值。

（二）SDS-PAGE电泳检测

1.待测蛋白质样品的制备

(1)向蛋白样品中加入适量的PBS，涡旋振荡重悬样品，加入1/2体积的3×上样缓冲液,混匀。

(2)100℃加热煮沸15min

(3)12000 rpm室温离心5min，取上清液进行电泳，剩余样品-20℃保存。

2.电泳槽准备

取洁净的玻璃板和凹形橡胶框等，按说明书装好电泳槽，长玻璃板下端与橡胶框底之间有一缝隙，用融化的1%的琼脂糖 (配制在电极缓冲液中)封底，待琼脂糖完全凝固后，准备灌胶。

3.垂直平板电泳胶的制备

表2 SDS-PAGE凝胶组分Table2 Componentsof SDS-PAGE gel

按表2配制分离胶与压缩胶，先灌入2/3的分离胶，然后立即用水饱和的异丁醇或异戊醇封胶，封胶后保持不动。待胶凝后将封胶液倒掉，并用ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻。

灌好浓缩胶后1h拔除梳子，拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

4.电泳

(1)用垂直电泳槽进行电泳，上样前将胶板下的气泡赶走。

(2)用微量进样器每孔加入处理好的蛋白样品10μl，所有蛋白样品调至等浓度后上样。

(3)上槽加入200 mL 1×loading buffer，下槽加入 200 mL 0.5×loading buffer。以初始电流15mA的电流强度进行稳流电泳，当溴酚蓝带泳动至压缩胶与分离胶的界线处时，将电流升为25mA。

(4)在溴酚蓝带泳动至距胶下缘1.5 cm时结束电泳，取下凝胶进行AgNO3染色。整个电泳时间约4～5 h。

5.银染

（1）电泳后凝胶在固定液中固定1 h以上（一般过夜），不可摇动。

（2）用清洗液浸泡3次，5min～20min～5min

（3）在定影液中反应2min后，用dd H2O洗涤3次，每次5min。

（4）在染色液中反应30min，用dd H2O洗涤2次，每次20 s。

（5）在显影液中浸泡数分钟，直到显现蛋白条带。

（6）加入终止液，使反应停止。

（7）用dd H2O洗涤，凝胶在10%醋酸中保存。

（三）EMSA实验检测核蛋白活性

1.材料准备：

（1）核蛋白的准备：按标准方法提取家蚕雄性脂肪体核蛋白，并进行过夜透析，冷冻干燥，使浓度达到1μg/μl以上。

（2）探针的准备：由上海生工合成25 nt的polyURNA序列，进行5’末端标记，标记后进行纯化，并测定标记效率。

EMSA探针序列：5’UUAAUAAUAUAAGUG3’

2.EMSA结合反应:

(1)设置EMSA结合反应（如表3所示）

(2)按照反应体系加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，室温(20-25℃)放置10min，消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20min。

(3)电泳分析：先用200V预电泳1 h，再用200V电泳约3 h。

表3 EMSA反应体系Table3 Reaction system of EMSA

三、实验结果与分析

用大造5龄3天的脂肪体提取的细胞核蛋白抽提物经过透析、冷冻干燥后，用下列三种方法检测。首先用Bradford方法测定蛋白浓度测定，若达到1μg/μl以上再用SDS-PAGE电泳检测其纯度，提取过程中得到的细胞质蛋白做对照，得到比较纯的细胞核蛋白。最后使用EMSA方法检测其活性,得到体外剪接可用的细胞核蛋白。

（一）Brad ford方法测定蛋白浓度

按照Bradford方法测定细胞核蛋白浓度。一般情况下，最后一步加入3.5mL考马斯亮蓝G-250测定工作液时，蓝色变化越明显，浓度越高。每次测定三个值，取其均值。当浓度达到1μg/μl以上，再用SDS-PAGE电泳检测提取的纯度。

（二）SDS-PAGE电泳检测

按照细胞核蛋白提取的方法与步骤提取的蛋白，用实验方法步骤（4）中得到的细胞质蛋白作为对照，进行SDS-PAGE电泳。检测细胞核蛋白的纯度，检测结果显示如图1 A。

由图可知，提取的核蛋白纯度比较高，没有太多细胞质蛋白的混杂。

（三）EMSA检测核蛋白活性

提取的细胞核蛋白用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度后，进一步采用EMSA方法检测其活性，如图1B所示。

图1 A:细胞核蛋白SDS-PAGE电泳图 1,2:细胞核蛋白3:细胞质蛋白B:EMSA电泳图1:只加探针，无核抽提物 2:加标记探针和未标记探针，有核抽提物3:只加探针探针，有核抽提物Fig1 A:SDS-PAGE electropherogram of cellnucleoprotein 1,2.:cellnucleoprotein 3.:cytoplasm albumenB：EMSA electropherogram 1:added only probes,nonuclear extract 2:added labeled and non-labeled probe,with nuclearextract 3:added labeled probe,with nuclear extract

（四）细胞核蛋白抽提条件的优化

在细胞核抽提实验中，我们改进了刘进元翻译的《转录因子实用技术》中HeLa细胞核提取物的制备的方法。将前面几步中的离心速度由500 g提高到5000 rpm。

在第一次使用匀浆器时，将重悬于缓冲液中的沉淀由匀浆10个冲程提高到40个冲程，而第二次匀浆时则由10个冲程提到到20个冲程左右。这样可以充分的将细胞核裂解。匀浆的冲程次数不是绝对的，要根据自己的力度大小决定，需要在实验中慢慢摸索。

（五）细胞核蛋白提取中的关键因素

细胞核抽提物如果处理和储存得当，好的剪接提取物可保存多年。为保持最佳的活性，提取后的细胞核蛋白要分装。在提取制备后一管剪接提取物只能经历两个冻-融周期。否则会影响其剪接活性。为了从组织中制备未降解的核蛋白，起始材料最好采用新鲜的。并且整个抽提实验操作在4℃房间进行，以防止蛋白降解。在细胞核抽提实验中使用的多种化学药品是有害的，应该采用防护措施如戴上手套，穿工作服。PMSF，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺等上有毒，干燥，呈气雾状的粉末，在称重时要注意防护。短半衰期的PMSF有剧毒，在水溶液里易于处理。故在处理容器或洗涤之前，那些接触过PMSF或者丙烯酰胺的容器可用水彻底清晰。

四、结论

以家蚕脂肪体为材料提取核抽提物，SDS-PAGE电泳及迁移率变动实验表明所抽提的核提取物质量较好，可用于后续的实验。制备的细胞核提取物可用于体外剪接，及迁移率变动分析中。

[1]Ohbayashi F,SuzukiMG,Shimada T.sex determination in Bombyxmori.currentscience.2002,8,83(4):466～470.

[2]Zeltlln S,Etstrauads A.in vitro spilicing products of the Rabbit β-Globin pre-mRNA.Cell,1984,31:589.

[3]郑晓飞.RNA实验技术手册.第一版.北京:科学出版社,2004,258～259.

[4]刘进元.转录因子实用技术.清华大学出版社.2004.