浅析兔抗猪高致病性蓝耳病高免血清的制备和鉴定

邓大旺 陈丽萍 崔健扬

（广东省东莞市动物卫生监督所长安分所，东莞 523845）

1 前言

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），又称为猪蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种接触性传染病，以母猪发热、厌食、流产、胎儿干尸化、产弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征（Done S H et al，1996）[1]。PRRSV根据抗原性差异分为欧洲型和美洲型，我国主要流行美洲型。研究显示，我国流行的美洲型产生了变异。2006年5月起在我国南方部分地区开始流行猪的“无名高热病”，经研究证实是由PRRSV变异株引起的高致病性猪蓝耳病（HPPRRS）。

为了诊断和控制PRRS，我国各地兽医工作者相继建立了一些诊断方法，其中以酶联免疫吸附试验（ELISA）的进展最为迅速，如我国简中友等（1997）[2]、董永毅等（1998）[3]等建立了间接ELISA，但到目前为止，国内尚未有成熟的供诊断的试剂盒，对PRRS的检测主要依赖于进口试剂盒和一些不宜推广应用的实验室方法，如间接免疫荧光试验（IFA）、免疫过氧化物酶单层试验（IPAM）、血清中和试验（SN）等。

为了为建立更准确、快速、敏感的PRRSV检测方法奠定基础，本实验将高致病性蓝耳病病毒（HPPRRSV）增殖后，经灭活、乳化制成油佐剂抗原多次免疫试验兔，获得兔抗PRRSV高免血清，并用间接ELISA检测出其效价。

2 材料与方法

2.1 材料

HPRRSV种毒；实验动物为3只新西兰大白兔；Mac-145细胞；一次性0.22 μm过滤器、细胞瓶和10 ml吸管及高糖DMEM营养粉、新生牛血清、胰酶，青霉素、链霉素。ELISA抗体检测试剂盒由深圳市绿诗源生物技术有限公司提供。

2.2 方法

2.2.1 细胞培养

将长满单层的Marc-145细胞先倒掉培养液，使用配制的胰酶溶液洗1遍，然后再加入胰酶溶液，在37℃条件下，消化约5～10 min，直至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒掉消化液，拍打瓶底，使细胞脱落。加入生长液约5～6 ml，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装与2～3个细胞瓶中。再在每个细胞瓶中补充生长液至13 ml，然后置37℃5%CO2培养箱中培养，培养1～2 d后即可长成单层。

2.2.2 病毒增殖

取HPPRRS种毒0.5 ml，接种长满单层的Marc-145细胞，在37℃5%CO2培养箱中吸附45 min～1 h后，弃去其中的维持液，用DMEM液洗涤细胞1～2次，再加入13 ml维持液后，在37℃5%CO2培养箱中培养4～6 d，观察2次/d，查看病变发生情况。如果没有病变，则－20℃冻融2～3次，再继续传至第3代，若仍无病变，则废弃。待接毒的Marc-145细胞出现细胞病变（CPE），即细胞拉网、融合、灶状脱落，而对照组细胞的形态仍然良好时收毒。

2.2.3 免疫抗原制备

取上述病毒培养液，加入0.2%甲醛，37℃过夜灭活。分别和等量的弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后制成免疫用抗原。

2.2.4 免疫接种

3只青年新西兰大白兔分为2组，A组（2只）为试验组，B组为对照组（1只）。A组：兔子编号为01和02，B组对照组：兔子编号为03。试验兔免疫情况详见表1～表3。

表1 首次免疫接种情况表 （8月19日）

表2 第二次免疫接种情况表 （9月3日）

表3 第三次免疫情况表 （9月25日）

最后1次抗原免疫后第10 d，从兔心脏采血，分离血清，经离心去掉红细胞等组织碎片后，分装待用。

2.2.5 高免血清ELISA效价的测定

PRRSV抗体的检测方法及判定标准均按试剂盒说明书进行。

（1）加入被检血清（01号兔血清、02号兔血清）：取预包被的微孔板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液分别将待检血清作40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120倍稀释后加入板孔中。每孔加100 μL。并且10倍稀释阴性、阳性对照血清，阴性、阳性对照各设2孔，每孔100 μL。另设一空白对照孔，空白对照孔加100 μL稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30 min。

（2）洗涤：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，300μL/孔，每次静置3 min倒掉，最后一次在不掉屑吸水纸上拍干。

（3）加入酶标记抗体：每孔加酶标二抗（羊抗兔IgG-HRP结合物）100μL，置37℃温育60 min。

（4）洗涤：与步骤（2）相同。

（5）加入底物溶液（TMB溶液）：每孔加底物A液、B液各1滴（50μL），混匀，室温避光反应10 min。

（6）加HF终止液：每孔加终止液1滴（50μL），10 min内测定结果。

（7）结果判定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630值。

试验成功的条件是阳性对照孔平均OD630值≥0.6，阴性对照孔平均OD630值≤0.1。样品OD630值≥0.32，判为阳性；样品OD630值≤0.32，判为阴性。

3 结果与分析

3.1 接毒后细胞病变图片

HPPRRS接种到长满单层的Marc-145细胞，4～6 d后Marc-145细胞出现CPE现象，详见图1。

图1 CPE以及正常细胞对照图200x

3.2 间接ELISA法的检测结果

从表4中可以看出，实验阴阳对照组成立，结果可靠，高免血清的效价为1∶1280。

表4 高免血清ELISA效价测定结果

4 讨论

自20世纪80年代PRRS暴发以来，免疫接种一直是预防PRRS的最重要措施。但近年来由于该病亚临床性流行病例的出现，对该病的诊断技术越来越受到各国有关部门的重视，并相继建立了IFA、IPAM、SN、ELISA和RT-PCR等方法。其中ELISA方法因具备稳定性好、自动化程度高等优点，已成为常用的检测方法[4-5]。

为了让ELISA法更适合检测PRRSV刺激机体产生不同抗体的需要，本实验将高致病性蓝耳病病毒（HPPRRSV）增殖后，经灭活、乳化制成油佐剂抗原多次免疫试验兔，获得兔抗HPPRRSV效价高达1∶1280的高免血清，为建立更准确、快速、敏感的PRRSV检测方法奠定基础。

[1] 郭宝清，陈章水，刘兴文，等.从疑似PRRS流产胎儿中分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病，1996，17（2）：1-4

[2] 简中友，马志勇，姜平，等.ELISA检测PRRSV抗体方法的建立及血清流行病学调查[J].中国动物检疫，1997，14（5）：24-26

[3] 董永毅.猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的研究[J].南京农业大学硕士论文，1999

[4] Wootton S，Rowland R R，Yoo D.Phosphory1 ationof thenucleocapsidproteinofporcinereproductiveand respiratorysyndromevirus[J].JVirol，2002，76：10569-10576

[5] Sarah K W，Dongwan Y.Homo-oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages[J].JVirol，2003，77（8）：4546-4557