不同猪源对猪肝金属硫蛋白的诱导效果的研究

燕 艳 李 牧 季志会* 杜 伟 董 金 张春兰 陈 健

（1.北京市通州区科学技术委员会，北京 101101；2.北京市通州区植物保护站，北京 101117）

金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类广泛存在于生物体内的低分子量富含半胱氨酸、能被金属结合的蛋白[1]。MT的生物学意义涉及生物机体微量元素贮存运输和代谢、重金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基以及机体生长发育、生殖衰老、肿瘤发生、免疫应激反应等各个方面，其研究涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域[2]。因此，开展金属硫蛋白在不同猪源猪肝中金属硫蛋白产量规律研究，对提高金属硫蛋白产量方面有着重要意义。

本研究以不同品种杂交猪为试验对象，利用ZnS04·7H2O进行腹腔注射，验证高剂量锌对不同猪种作用，研究其对肝脏金属硫蛋白含量的影响。对高剂量锌在不同猪源中诱导猪肝金属硫蛋白含量进行检测，为提高猪肝金属硫蛋白含量的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

品种Ⅰ 杜×长×大三元杂交猪购于东方种猪场。

品种Ⅱ 杂种野猪（野猪♂×杜洛克♀）购于通州区特种经济动物养殖总场。

品种Ⅲ 国内品种猪种 大白（♂）×荣昌（♀）。

品种Ⅳ 杜洛克（♂）×大白（♀）。

表1 试验日粮配方及其营养成分

1.2 主要试验试剂及其配制

主要试验仪器：组织匀浆器（英国，MSN公司）；高速冷冻离心机（日立公司）；超滤机及膜包（美国PALL公司）；低温冻干机（德天佑公司）；AKTA系统（美国GE公司）；UV分光光度计（上海尤尼柯公司）

锌诱导剂：ZnS04·7H2O（分析纯）MT（购自American）

巯基试剂的配制：称取DTNB 297.15 g，盐酸胍85.95 g，EDTA 55.8 mg用0.1 MPBS溶解并定容至500 ml。

1.3 试验方法

饲养试验共4个品种平均重量8 kg左右的猪，在相同饲养管理条件下预试7 d后，分成4组（每组设3个重复，每个重复10头）。每组用配制好的ZnSO4·7H2O溶液采用腹腔注射法进行诱导，每隔1 d诱导1次。共诱导5次，每次剂量分别为10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg，累计330 mg/kg，诱导结束24 h屠宰取肝脏[3]。

1.3.1 金属硫蛋白的提取

取新鲜猪肝样3～5 kg用0.02 mol/LTris-HCl（pH8.6）与猪肝同体积捣碎搅拌匀浆，冷冻离心（8 000 r/min，4℃，30 min），取上清液于另一离心管；再加同体积无水乙醇，搅拌5min，冷冻离心（8 000 r/min，4℃，30 min），离心后取上清液于另一离心管；放入80℃的水浴锅内水浴5 min，取出后迅速冷却至室温，再冷冻离心（8 000 r/min，4℃，30 min），取上清液超滤浓缩至200 ml的溶液。

进行SephedexG50柱层析，用0.01mol/LNH4HCO3进行洗脱，用巯基试剂进行检测，收集着色洗脱液；在－80℃下冷冻25 h，所得冻干样即为MT。

1.3.2 金属硫蛋白的巯基显色检测法

将金属硫蛋白粗提液加入巯基试剂（1∶1），在分光光度计420 nm处读取吸光度A值。用标准MT纯品制作标准曲线，根据A值可在标准曲线上读出生产的MT浓度[4]。

2 结果与讨论

2.1 金属硫蛋白与吸光度A值的关系

采用纯的MT（纯度为99.7%）配成1 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、2.5 mg/ml、3mg/ml的MT标准液，用紫外可见光分光光度计在420 nm下读取以上各标准液的吸光度A值，MT的浓度与A值的关系为：

Y=0.0713X （Y为A值，X为MT的浓度，R2=0.9916）

锌诱导不同猪源猪肝中MT的含量，可通过巯基显色，并用分光光度计读取各诱导样的A值，然后再从MT标准曲线上查出（见表2）。

表2 锌诱导不同猪源猪肝金属硫蛋白的合成量

2.2 不同品种的猪源对金属硫蛋白合成量的影响

锌诱导生成的Zn-MT能被多种金属置换，在重金属解毒方面起着重要作用，同时结合在MT中的Zn还能够行使其它生物学功能，因此锌被公认为最安全最有效的MT诱导剂[5]。

腹腔注射诱导乳猪会增强乳猪对锌的耐受性和适应性，本试验通过硫酸锌诱导后研究结果表明：由表1可见不同品种平均体重8 kg左右的乳猪，经过屠宰诱导后猪肝平均体重依次为，品种Ⅲ>品种Ⅳ>品种Ⅰ>品种Ⅱ，金属硫蛋白含量70%以上的提取量大小依次为，品种Ⅲ>品种Ⅳ>品种Ⅰ>品种Ⅱ。经分析表明荣昌与大白杂交的乳猪品种具有体躯较长、腹大而深、肝脏较大等特点，在相同饲养和诱导条件下可以提高金属硫蛋白产量，每头体重在8kg左右的乳猪金属硫蛋白提取量达到了1.08 mg，相对市售杜长大大杂交猪提取金属硫蛋白含量提高了36%。因此该品种可降低生产成本，适合产业化生产。

[1] 张桂春.金属硫蛋白的功能及应用前景[J].烟台师范学院学报，2005，21（1）：142-145

[2] 邢树礼，王洪光.金属硫蛋白的功能及应用前景[J].生物技术通报，2008，（2）：45-48

[3] 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术[M].北京：高等教育出版社，1987，216-218

[4] 许梓荣，王敏奇.高剂量锌促进猪生长的机理探讨[J].畜牧兽医学报，2001，32（1）：11-17

[5] 张博润，蔡向荣，怀文辉，等.金属硫蛋白的研究进展及应用前景[J].微生物学通报，1999，26（5）：355-357