丽江大黄中多羟基芪类成分的提取工艺研究

王小艳，张璐璐，索有瑞*

1中国科学院西北高原生物研究所;2青海伊纳维康生物科技有限公司，西宁810001

丽江大黄中多羟基芪类成分的提取工艺研究

王小艳1，张璐璐2，索有瑞1*

1中国科学院西北高原生物研究所;2青海伊纳维康生物科技有限公司，西宁810001

本文采用正交实验，以Rhapontin和Desoxyrhaponticin的总含量为指标，运用HPLC含量分析测定法，研究了丽江大黄中多羟基芪类成分的提取工艺。结果表明:以料液比1∶12，提取温度65℃，pH=7，浓度为90%乙醇回流提取2 h为最佳提取条件，在此条件下提取的多羟基芪类成分Rhapontin和Desoxyrhaponticin的总含量为104.98 mg/g。

丽江大黄;多羟基芪类成分;提取工艺;正交实验

丽江大黄(Rheum likiangense)又称黑七或雪三七，为蓼科(Polygonum L.)大黄属(Rheum L.)波叶组植物，生于海拔2500～4000 m的林缘山坡或灌丛沟谷，主要分布于西藏、四川及云南省，在青海省内主要产于玉树、治多、囊谦等地［1，2］。丽江大黄属于非正品大黄［3］，但在我国民间常用于治疗外伤出血或内服治跌打损伤和痢疾，其药理作用具有较大的开发价值［4］。随着正品大黄资源的逐渐匮乏，从非正品大黄中寻找新的药源植物并开辟大黄植物资源的新用途亦显得非常必要。

文献报道称非正品大黄中主含有丰富的多羟基芪类成分，并且近年来不少研究证明多羟基芪类成分具有降血脂、扩张毛细管改善微循环、抗肿瘤、抗菌、抑制过敏反应、调节机体免疫防御系统等作用［5］，例如华北大黄及河套大黄中含有的丰富的Rhapontin和Desoxyrhaponticin等成分具有降血脂、降血糖活性［6，7］。本文以非正品大黄中的丽江大黄作为研究对象，以Rhapontin和Desoxyrhaponticin的总含量作为评价指标，通过正交实验优选出了丽江大黄中多羟基芪类成分的最佳提取工艺并测定其含量，以期为丽江大黄资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

实验用丽江大黄(Rheum likiangense)全植株采自青海玉树地区，并经本研究所吴征兰老师鉴定。取丽江大黄新鲜根部，自然干燥、粉碎、备用。

1.2 仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪(配有:四元泵、标准型自动进样器、柱温箱、Agilent DAD检测器); HH-4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司);R-201旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司);JA1003电子天平(上海精科天平);回流装置。

Rhapontin和Desoxyrhaponticin对照品均为中科院西北高原生物研究所自制，经检测纯度均大于98%;乙醇、氢氧化钠、盐酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱:大连依力特(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱温:25℃;流动相:甲醇-乙腈-水梯度洗脱，洗脱程序见表1;流速:1.0 mL/min;检测波长:320 nm。此条件下对照品与样品的HPLC色谱分离图见图1。

表1 洗脱程序Table 1 Elution program

图1 对照品(A)和丽江大黄提取液(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and crude extract of R.likiangense(B) 1.Rhapontin(10.4 min);2.Desoxyrhaponticin(28.1 min)

1.3.2 标准曲线的制备

着重以省、市两级果树方面的科研技术服务团队为支撑，区级农技人员为栽培技术学习和传播的载体，加大对乡镇级农技人员、樱桃种植企业、合作社技术员及农户关于建园、栽培、水肥管理、整形修剪、花果管理、采收以及病虫害等技术环节的培训力度，并积极宣传樱桃优新品种及其生态高效栽培技术，提高各层次人员对樱桃规范化种植的认识，不断提高樱桃生产管理技术水平。

分别精密称取 Rhapontin和 Desoxyrhaponticin对照品5.4 mg和5.3 mg，置于10 mL容量瓶中用50%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。以高效液相色谱仪自动进样器分别精密进样2、4、6、8、10、12 μL对照品溶液进行分析测定，以峰面积Y对进样量X(μg)进行线性回归，得回归方程Rhapontin:Y=2968.6X-2.1867(R2=0.9999)，线性范围为1.018～6.108 μg;Desoxyrhaponticin:Y= 3762.2X+249.37(R2=0.9998)，线性范围为1.04～5.20 μg。

1.3.3 样品的提取

分别称取丽江大黄粉末10 g置于圆底烧瓶中，按正交实验设计的条件分别进行水浴加热回流提取，提取后过滤并定容于250 mL容量瓶中，再分别吸取上述提取液5 mL置于25 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即为供试液。

1.3.4 供试液含量测定

分别吸取上述供试液，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，按照1.3.1项下的高效液相色谱条件进样10 μL进行分析测定，以外标法分别计算样品中Rhapontin和Desoxyrhaponticin的含量，并以两者含量的总和作为样品中多羟基芪类成分的含量。

2 结果与分析

2.1 提取工艺正交实验

选取了乙醇浓度、pH值、料液比、温度、提取时间等影响提取效果的五个因素进行了L16(45)正交实验考察，因素水平见表2。

表2 正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2.2 正交实验结果分析

以正交实验各提取样品中Rhapontin(R)和Desoxyrhaponticin(D)两种多羟基芪类成分的总含量为考察指标，对正交实验结果进行数据分析，见表3。

表3 正交实验结果及数据分析Table 3 Results of orthogonal test and data analysis

由正交实验结果可知，各因素对丽江大黄中多羟基芪类成分的提取效果影响程度依次为:乙醇浓度＞料液比＞提取时间＞提取温度＞pH值。

从上述正交实验结果直观分析表中可得出，丽江大黄中多羟基芪类成分的最优提取工艺条件为: A4B3C4D3E2，即90%乙醇，pH=7，料液比1∶12，温度65℃，提取时间2 h。由于该组合不在正交实验表内，经实验验证，该最优工艺条件下提取的多羟基芪类成分的总含量可达104.98 mg/g，此条件下得到的丽江大黄提取液的HPLC分离图见图1(B)。

3 讨论

3.1 本文首次研究报道了青海玉树地区野生丽江大黄中多羟基芪类成分Rhapontin和Desoxyrhaponticin的含量;同时建立了这两种成分的HPLC定量分析方法;并以这两种成分为评价指标，研究确定了丽江大黄中多羟基芪类成分的最优提取工艺，为青海丽江大黄植物资源的深度开发利用提供了科学依据。

3.2 为了提高植物原料的利用率以做到物尽其用，本文还筛选确定了丽江大黄的药用器官部位，分析测定结果表明:多羟基芪类成分在丽江大黄植物的根中含量最为丰富，而根皮中的含量是根中含量的81.8%，因此，如果以多羟基芪类成分作为丽江大黄(非正品大黄)的药效指标成分，那么根皮也可作为重要的药用器官部位。这一点与大黄药材的传统加工炮制要求(去皮根入药)并不相同。此外，叶柄中的含量约为根中含量的1.33%;叶片中的含量约为根中含量的0.61%;而在茎和种子中均未检出。

3.3 中国的大黄属植物约有45种，而《中国药典》收载的大黄只有3种;虽然中国开发利用大黄的历史悠久，但其药用范围较为单一，多偏重于泻下功效。因此，需要加强对大黄中众多生理活性成分(例如多羟基芪类成分)的研究，以期扩大大黄的药用范围，并从大黄属的近缘植物中寻找到新的药源植物，开辟和丰富大黄资源的用途。

1 Editorial Committee of Flora of China of Chinese Academy of Sciense(中国科学院中国植物志编辑委员会).Flora of China(25)(中国植物志第25卷).Beijing:Science Press，1998:180.

2 Editorial Committee of Flora of Qinghai of Northwest Plateau Institute of Biology of Chinese Academy of Sciense(中国科学院西北高原生物研究所青海志编辑委员会).Flora of Qinghai(1)(青海植物志第1卷).Xining:Qinghai People’s Publishing House，1997:158.

3 Xie ZQ(谢宗强).Element concentrations in Rheum palmatum and R.likiangense plants and soil in Tibet plateau.Chin J Appl Ecol(应用生态学报)，2000，11:903-906.

4 Xie ZQ(谢宗强).Studies on certain ecological characteristics of Rheum likiangense in Yushu，Qinghai.Acta Ecol Sin (生态学报)，2000，20:815-819.

5 Liao ZY(廖志云)，Wu ZZ(吴祖泽).Advances in research on biological activities and structure effect relationship of polyhydrostilbenes.Bull Acad Mil Med Sci(军事医学科学院院刊)，2004，28:492-494.

6 Wang JJ(王娟娟)，Chen ZQ(陈志强)，Wang SX(王顺喜).Measurement of desoxyrhaponticin in Rheum franzenbachii by high performance liquid chromatography.Acta Agric Jiangxi(江西农业学报)，2008，20(5):59-60.

7 Chen ZQ(陈志强)，Zhang WY(张文懿)，Zhang XL(张学良).et al.Preparative separation of polyhydrostilbenes Rhapontin from Rhapontineum hotaoense C.Y.Cheng et C.T.Kao.by HPLC.Chin Tradit Patent Med(中成药)，2004，26:932-933.

Extraction Process of Polyhydroxystilbenes from Rheum likiangense

WANG Xiao-yan1，ZHANG Lu-lu2，SUO You-rui1*1Northwest Plateau Institute of Biology，Chinese Academy of Science;2Qinghai Innovator Biotech Co.Ltd，Xining，810001

In this paper the extraction process of polyhydroxystilbenes from Rheum likiangense was investigated by orthogonal experiment with contents of Rhapontin and Desoxyrhaponticin as indexes.Their contents were determined by HPLC.The optimum conditions for extraction are as follows:the solid-liquid ratio 1∶12，the temperature 65℃，the ethanol content 90%，pH=7，and extraction time 2 h.Under the optimal extract conditions，the total contents of two polyhydroxystilbenes including Rhapontin and Desoxyrhaponticin were 104.98 mg/g.

Rheum likiangense;polyhydroxystilbenes;extraction process;orthogonal experiment

1001-6880(2012)08-1105-04

2011-09-14 接受日期:2011-12-23

中国科学院“知识创新工程领域前沿”项目

*通讯作者 Tel:86-971-6143857;E-mail:yrsuo@nwipb.cas.cn

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