茯苓多糖抗氧化性研究

李燕凌，张志旭，胡 令

1湖南省蔬菜研究所，长沙410125;2国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，长沙410128;3湖南信息科学职业技术学院，长沙410151

茯苓多糖抗氧化性研究

李燕凌1，张志旭2*，胡 令3

1湖南省蔬菜研究所，长沙410125;2国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，长沙410128;3湖南信息科学职业技术学院，长沙410151

采用分光光度法研究了茯苓多糖提取物的体外抗氧化作用，并与VC进行比较。结果表明其具有较强的抗氧化能力，在清除DPPH·的体系中和还原能力体系中，样品的清除能力均超过VC，但在羟基自由基·OH和超氧阴离子O-·2体系中，其清除能力低于对照样VC。

多糖;茯苓

茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核，为我国传统中药，是多种方剂及中成药的原料，有“十药九茯苓”之说。在我国主产地为湖南、湖北、安徽、河南、云南、贵州、四川等省［1］。氧化代谢是机体在生命活动必不可少的一个的过程，然而在这个过程中往往不可避免的产生各种活性氧自由基，这些物质很容易损伤组织，进而引起各种疾病，因此对抗氧化损伤的药物的研究日益受到人类的关注［2，3］。本文将对茯苓多糖的抗氧化能力进行测定，旨在为茯苓多糖药物及功能性食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

无水乙醇、三氯甲烷、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸萘乙二胺、邻苯三酚、三羟基氨基甲烷(Tris)等均为国产分析纯，1， 1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)购于Sigma公司

1.2 主要仪器

紫外分光光度计，日立UV-3310

1.3 实验材料

茯苓原料由湖南农业大学食用菌研究所提供。对茯苓采用热水提取法获得水溶性粗多糖，然后用离子交换树脂和大孔吸附树脂对茯苓多糖溶液脱色，用sevag法除蛋白，最后得到茯苓多糖，经检测多糖含量为95.26%。根据实验要求配制不同溶度的茯苓多糖溶液进行抗氧化实验。

1.4 抗氧化测定

1.4.1 试剂的配制

1.4.1.1 pH 7.4的磷酸盐缓冲液的配制:将无水磷酸氢二钠和磷酸二氢钾在115±5℃干燥2～3 h，分别称取8.606 g与2.358 g，加水使其充分溶解后，并稀释，定容至2000 mL。

1.4.1.2 50 mmol/L，pH8.2 Tris-HC1缓冲溶液的配制:取25 mL 0.l mol/L Tris与15 mL 0.1 mol/L HC1混匀，加水定容到50 mL，即可得到pH 8.2的缓冲溶液，用酸度计测其pH值。若该缓冲溶液的pH值误差不在0.02范围之内就必须重新调 pH值。

1.4.1.3 8 mol/L的HCl溶液的配制:取144 mL分析纯的HCl用蒸馏水定容至200 mL。

1.4.2 清除羟基自由基(·OH)能力的测定［3］

首先取浓度为2.5 mmo1/L的邻二氮菲溶液3 mL，然后取2.0 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液，将两者充分混匀，加入15 mmo1/L的FeSO4溶液0.5 mL后，立即混匀，再加入l.0 mL/L的H2O21.0 mL，最后使用蒸馏水将剩余体积补充至10.0 mL，在温度为37℃条件下保温，1 h后取出，在510 nm处测定吸光度(此为损伤管吸光度);之后分别加入浓度不同的试样溶液1 mL，再加l.0 mL/L的H2O21.0 mL，未损伤管不需要加提取物和H2O2。按下式计算清除率:

式中:A0—未损伤管的吸光度

A1—损伤管的吸光度

A2—加提取物的吸光度

取4.5 mL Tris-HCI缓冲溶液，于20℃水浴中进行预热，20 min后，分别加入1 mL不同浓度的试样溶液和0.4 mL浓度为25 mmo1/L的邻苯三酚溶液，充分混匀后，于25℃水浴中反应5 min，然后加入1 mL浓度为8 mo1/L的HC1溶液终止反应，最后在299 nm处测定吸光度A1，空白则以蒸馏水代替样品液，测定吸光度A0。按下式计算清除率:

1.4.4 清除DPPH·能力的测定［5］

分别取2 mL浓度不同的样品液放置于试管中，加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液，混合均匀，反应30 min，在513 nm处测定其吸光度，同时测定样品空白的吸光度，以及不加样品液的空白样的吸光度。按下式计算其对DPPH抑制率:

式中:A1=2 mL DPPH·溶液+2 mL样品液的吸光度;

A2=2 mL样品液+2 mL无水乙醇的吸光度;

A0=2 mL DPPH·溶液+2 mL无水乙醇的吸光度。

1.4.5 还原能力的测定［8］

分别取不同浓度的样品液2.5 mL加入到体积为2.5 mL的pH=6.6的磷酸盐缓冲液中，然后加1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀后在50℃条件下恒温，20 min后，再加入2.5 mL浓度为10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 rpm离心分离l0 min，取上层清夜5 mL加蒸馏水5 mL和0.1%FeCl3溶液1 mL，在700 nm处测定吸光度，吸光度越高，还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 茯苓多糖提取物对·OH的清除作用

如图1所示，试验用Fenton法考察茯苓多糖和Vc对·OH清除效果，与对照组比较P＜0.01。样品的清除率在试验浓度范围内与样品浓度呈正相关，但低于对照样VC，当样品浓度为8 mg/mL时，清除率达到了76.7%。

图1 不同浓度的茯苓多糖对·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect on·OH by different concentration of polysaccharides from P.cocos

如图2所示，样品在试验浓度范围内，清除率与样品浓度呈正相关，与对照组比较P＜0.01。清除率低于对照品Vc，而且一直低于60%。在10 mg/ mL时基本达到最大值为59.3%。

图2 不同浓度的茯苓多糖对O的清除作用Fig.2 Scavenging effect on Oby different concentration of polysaccharides from P.cocos

2.3 茯苓多糖提取物对DPPH·的清除作用

如图3所示，清除率在一定的实验浓度范围内与样品浓度呈正相关，与对照组比较P＜0.01。当样品浓度大于0.5 mg/mL时，其清除率大于 Vc。Vc在浓度在为0.5～3 mg/mL时，随着浓度增加DPPH清除率增加较快，之后则趋于稳定，即使这样其清除能力仍然一直低于样品，样品浓度为5 mg/ mL时，样品清除率基本到达最大值，为93.4%。

图3 不同浓度的茯苓多糖对DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effect on DPPH·by different concentration of polysaccharides from P.cocos

2.4 茯苓多糖提取物还原能力的测定

如图4所示，样品的还原能力在试验浓度范围内与样品浓度呈正相关，与对照组比较P＜0.01。在浓度大于2 mg/mL后，样品还原力大于Vc。Vc浓度在0.5～3 mg/mL时还原能力增加较快，之后则趋于稳定。但其清除能力一直低于样品。当样品浓度为5 mg/mL时，达到最大的还原力为0.942。

图4 不同浓度的茯苓多糖还原力测定Fig.4 Assay of reducing ability by different concentration of polysaccharides from P.cocos

3 结论

通过对四种不同的体系自由基清除率的测定，研究了茯苓多糖提取物的抗氧化性能。结果表明，其具有较强的抗氧化能力和抗氧化的多样性，在·OH和O-·2体系中，虽然其清除能力低于对照样VC，但也显示出较强的自由基清除能力，作用机理可能是多糖分子上具有还原性的半缩醛羟基，与活性氧自由基发生氧化还原作用，·OH可快速地获取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自由基，进一步氧化形成过氧化自由基，最后分解成对机体无害的产物，可将激发能传递给多糖，使多糖处于激发态而本身回到基态［10］。在清除DPPH·的体系中和还原能力体系中，样品的清除能力均超过VC，这两个体系中，自由基的基础基团为有机大分子，茯苓多糖分子容易捕获自由基并与其结合，因此显示出较强的自由基清除能力。随着浓度的升高，多糖溶液达到饱和，多糖分子之间互相产生排斥，对于自由基的捕获能力下降，清除能力达到饱和。茯苓在中国已经得到了广泛的栽培，本文通过体外试验方面证明了茯苓多糖提取物具有很强抗氧化性能，为茯苓多糖提取物进一步开发成特异性的抗氧化功能产品提供了理论依据。

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10 Zhou LZ(周林珠)，Yang XL(杨祥良)，Zhou JY(周井炎)，et al.The research development of antioxidation from polysaccharides(多糖抗氧化作用研究进展).Chin J Biochem Pharm(中国生化药物杂志)，2002，23:210-212.

Antioxidation of Polysaccharides from Poria cocos

LI Yan-ling1，ZHANG Zhi-xu2*，HU Ning31Hunan Vegetable Institute，Changsha 410125，China;2State Key Laboratory of Subhealth Intervene Technology，Changsha 410128，China;3Hunan Information-science Technology College，Changsha 410151，China

The research compared antioxidation in vitro of polysaccharides from Poria cocos with Vc by using spectrophotometry.The results showed that polysaccharides from P.cocos had powerful ability of antioxidation.In the system of DPPH·and reducing system，the sample was superior to Vc in scavenging ability.But it was inferior to Vc in the system of hydroxyl radical and superoxide anion.

polysaccharides;Poria cocos

1001-6880(2012)08-1126-03

2011-08-01 接受日期:2011-11-02

*通讯作者 Tel:86-018684688522;E-mail:youknowme@tom.com

R284.2;R285.5

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