正交设计金英黄归液透皮剂的制备

郭 庆，何炳坤，易 琼，朱 伟，李圆方，王 鲁

（1.贵州大学 贵州省生化工程中心，贵州 贵阳550025；2.安徽科宝生物工程有限公司，安徽 淮北235025；3.北京生泰尔生物科技有限公司，北京 昌平102206；4.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025）

近年来，中药治疗奶牛乳房炎越来越引起国内外学者的重视，且有些中药治疗明显优于青、链霉素类药物［1－2］，其大多通过口服和灌注方式给药治疗乳房炎。而使用透皮给药系统（Transdermal therapeutic system，TTS）给药治疗奶牛乳房炎也有报道［3－4］，用中药透皮剂治疗奶牛乳房炎既避免了肝脏首过效应，又降低了胃肠道的毒副反应和机体的应激反应，使其在奶牛乳房炎上具有广阔的应用前景，同时也为宠物临床用药提供参考依据。为此，本试验采用正交试验设计考查制备金英黄归液透皮剂的因素，并进行稳定性检测，通过透过率检测其透过效果。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 金银花、蒲公英、连翘、芙蓉花、瓜蒌、大黄、黄芪、当归等八味中药均为生药，购于贵阳市云岩区头桥中药店，并经贵州大学中药实验室鉴定；绿原酸标准品，购于中国药品生物制品检定所；有机化学试剂均为国产分析纯试剂；新鲜奶牛乳房皮肤。

1.2 主要仪器 UV－2000紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司），RE－5298旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），DHP－9162电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），DL－360B智能超声清洗器（上海之信仪器有限公司）。

1.3 中药提取制备 按中医药组方原则将黄芪、当归、蒲公英、大黄、连翘、瓜蒌、金银花、芙蓉花等进行组方。准确称取复方100g，用50%乙醇浸泡30min（料液比10∶1），然后超声15min，回流提取2h，多层纱布过滤。药渣再加50%乙醇（料液比8∶1），回流提取1h，多层纱布过滤，合并滤液，旋转蒸发至无醇味，加入石油醚萃取，水相浓缩至2g／mL，121℃流通蒸汽灭菌15min。灭菌后4℃保存备用。

1.4 离体奶牛皮肤的制备［5］取新鲜奶牛乳房皮肤，用8%硫化钠溶液去毛，剥离皮下脂肪及黏液组织，选取完整皮肤，用生理盐水洗净，浸于生理盐水中，4℃冰箱短期保存，备用。

1.5 正交设计中药透皮剂的制备 透皮剂为O／W型乳膏剂，根据文献［5］将基质配方（A）、乳化剂（B）、温度（C）作为可变因素进行考察，每个因素各取3个水平，选用L9（34）正交表进行试验。按表1所列量取硬脂酸、单硬脂酸甘油醋、液体石蜡、凡士林、羊毛脂共置同一容器中，水浴加热；将三乙醇胺、中药液28.5mL放入另一容器中，水浴加热，然后在等温条件下将两相混合，并不断搅拌10min，加入促进剂（5%氮酮和10%丙二醇）。再于室温条件下搅拌至冷凝，搅匀，制得中药透皮剂。分别取各中药透皮剂5g于离心管内，以3 500r／min离心，观察中药透皮剂分层时间，作为稳定性考察定量指标。另取上述配制的中药透皮剂各10g，于具塞玻璃瓶中密闭，根据客观情况，按膏剂的性状：分散度、软硬度、粘性等分类打分，所得总分越高，膏体性能越好。评分标准为：分散度（分散均匀即色泽一致3分、分散较均匀2分、分散差1分），软硬度（软硬适中3分，较软或较硬2分、太软或太硬1分），粘性（粘性适中不粘手3分、粘性较差粘手2分、粘性过强或过弱1分），根据中药透皮剂分层时间及性能两项指标，筛选最佳制备方案。

1.6 中药透皮剂的稳定性试验 取中药透皮剂10 g，放入带刻度离心管中，3 000r／min离心30min，进行离心试验，观察中药透皮剂是否有分层及破乳现象。另取中药透皮剂10g置于具塞试管内，分别置45℃恒温箱6h或－20℃冰箱24h，进行耐寒耐热试验，检查中药透皮剂是否有分层破乳以及色泽、均匀性改变等现象。再取中药透皮剂10g装入具塞试管内，置于温度为40℃±2.0℃，相对湿度为75%的恒温培养箱中，连续放置3个月，进行加速试验，定期检查，观察是否有分层破乳、霉败以及色泽、均匀性改变等现象。

表1 透皮剂制备试验因素水平表

1.7 中药透皮剂体外透过率的测定 采用紫外分光光度法［6］进行，准确称取绿原酸标准品5.0mg，用30%甲醇溶解并定容于50mL容量瓶中。再准确量取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分别加入刻度试管中，用30%甲醇溶液调至10 mL。于紫外分光光度计324nm处，测定其吸光度值（OD324值），重复3次，取平均值。以绿原酸标准品浓度为横坐标，以其吸光度值（OD324值）为纵坐标绘制标准曲线。

自制透皮扩散池，内径为1.8cm，接受池为6 mL，试验温度为37℃±2℃，搅拌速度为100r／min。释放池一端用离体牛皮覆盖，用缝合线扎紧，使皮肤角质层朝向管内，在管内加中药透皮剂1g（试验组）或未加促进剂的中药透皮剂（对照组）1g，接受池内加生理盐水6mL，使牛皮与接受液面接触，在37℃±2℃条件下，连续搅拌，分别于加样后1、2、4、6、8h取样1mL，紫外分光光度法检测绿原酸的透过量。每次取样后补加生理盐水1mL，重复3次，最后取平均值。并计算出每组各个时间点的累计透过量Q。按公式1计算累积透过量（Q），以累积透过量Q对时间t进行线性回归所得方程即为y＝k＋t＋b，其中斜率k即为透皮速率常数j（μg／cm2·h），用j来评价中药透皮剂透过效率。k按公式2计算。

式中，Cn：第n个取样点测得的药物浓度（μg／mL）；Ci：第1个取样点测得的药物浓度（μg／mL）；A：渗透面积（2.8cm2）。

式中，SPty为乘积和，是自变量t的离均差与依变量Q的离均差的乘积和，SSt为自变量t离均差平方和。

2 结果

2.1 中药透皮剂的制备 综合中药透皮剂分层时间和性能，由方差分析可见，A、B、C对试验指标的影响不显著（P＞0.05）。但对其影响顺序为A＞C＞B，即处方基质用量＞温度＞乳化剂用量。综合离心分层时间、分散度、软硬度、黏性指标，得出透皮剂最佳工艺为A2B1C2，即油相取硬脂酸12g、单硬脂酸甘油酯3.5g、羊毛脂5g、凡士林2g、石蜡6 mL；水相取三乙醇胺0.3mL，中药液28.5mL；在80℃时将两相混合不断搅拌10min，取出再于室温条件下搅拌即得。

2.2 中药透皮剂的稳定性 配方A2B1C2的中药透皮剂的离心试验、耐寒耐热试验和加速试验结果显示，其具有良好的稳定性，未发现分层、破乳、霉败及色泽、均匀性改变等。

2.3 中药透皮剂体外透过率的测定 将绿原酸标准溶液配制成系列浓度经测定后，以吸光度值（OD值）为纵坐标，绿原酸的含量为横坐标，求得标准曲线方程为y＝57.463x＋0.0491，R2＝1，说明绿原酸的质量浓度为0.005～0.03mg／mL时，用本方法检测具有良好的线性。

将1、2、4、6、8h时间点所测得的 OD值代入上述标准曲线方程，求得各点的绿原酸的透过量。按公式1计算累积透过量，按公式2计算透皮速率常数。可以看出，加5%氮酮和10%丙二醇的试验组的透皮速率常数为15.1μg／cm2·h，而对照组没有加促透剂的透皮速率常数为9.51μg／cm2·h。结果见表2。

表2 绿原酸的累积透过量（μg）

3 讨论

3.1 中药透皮剂主要由药物、基质和透皮吸收促进剂组成。目前常用的透皮剂的基质可分为油脂性基质、乳剂型基质和水溶性基质三类，其中药物在乳剂型基质中的释放、穿透、吸收速度最快，乳剂型基质可分为油包水（W／O）型与水包油（O／W）型两类，而O／W型基质比W／O型基质药物的释放和穿透快，所以本中药透皮剂的研制选用O／W型基质配方进行试验。正交设计结果表明，处方基质用量、乳化剂用量、温度均为不显著因素。综合离心时间、分散度、软硬度、黏性指标，得出透皮制剂最佳工艺为A2B1C2，即取硬脂酸12g、单硬脂酸甘油酯3.5g、羊毛脂5g、凡士林2g、石蜡6mL；三乙醇胺0.3 mL，中药液285mL；在80℃时将两相混合不断搅拌10min，取出再于室温条件下搅拌即得，这一试验结果为进一步制剂提供了良好的基础数据。

3.2 透皮剂制备完成后应色泽均匀，质地细腻，有适当的黏稠性，易于涂布皮肤，无粗糙感，具有一定的相对稳定性。为此，通过耐寒耐热试验、离心试验和加速试验检验采用A2B1C2工艺制备的透皮剂的稳定性。结果显示，采用该透皮剂具有良好的稳定性，各项稳定性结果均符合要求，对于有效期要求两年的产品，在温度37℃～40℃，相对湿度75%以上的条件下保存3个月，产品稳定，则可暂定为有效期两年［7］。所以该中药透皮剂的保质期暂可定为两年。

3.3 药物的透皮吸收主要是通过皮肤表面的药物浓度与皮肤深层的药物浓度差以被动扩散的方式透过角质层，皮肤角质层是药物透皮吸收的主要屏障。目前一般添加透皮吸收促进剂氮酮和／或丙二醇的方法来解决这个问题，根据文献报道［5］，我们选用添加5%氮酮和10%丙二醇两种促进剂来增加药物的透皮速率。由于中药透皮剂为复方制剂，成分较多，结构复杂，有关其透皮特点的基础研究比较困难，为此研究复方制剂的透皮效果一般以复方制剂中某种有效成分的透皮量作为评价指标［8］。本复方以金银花为主药，金银花有效成分主要有绿原酸，所以本研究通过测定中药透皮剂中绿原酸的体外透皮量，验证含5%氮酮和10%丙二醇对中药透皮剂的透皮效果。本试验采用紫外分光光度法测定绿原酸的透过量，结果表明，透皮剂中绿原酸的透皮速率常数J为15.1μg／cm2·h，这说明该中药透皮制剂具有明显的透过作用。

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［2］许瑾，孙彦河，杨春波，等.乳安注射液治疗奶牛乳房炎的效果试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2004（7）：56.

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［4］张喜丰.中药透皮剂对奶牛临床型乳腺炎的药效学研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2007.

［5］叶刚.纯中药透皮剂“乳炎克”的研制及初步药效学实验研究［D］.成都：四川农业大学，2006.

［6］乌兰，张泽生.金银花中绿原酸的提取及检测［J］.食品科学，2005，26（6）：130－138.

［7］Feldman E G.Consistency in Stability Testing［J］.Pharm sci，1979（68）：1.

［8］张爱华，王纯明，付太招，等.HPLC法测定蒲公英及保肝奶蓟草胶囊中咖啡酸的含量［J］.南京中医药大学学报：自然科学版，2002，18（5）：298－299.