探讨白血病患者骨髓中VEGF、bFGF、sICAM－1及CD105的表达对髓血屏障调节机制的影响

马传香，高昆山，刘树刚，李 骞，王树庆

（潍坊医学院附属医院，山东 潍坊261031）

大多数急性白血病和慢性粒细胞性白血病外周血中的白细胞增高，而部分急性白血病外周血白细胞不增高，甚至减少。髓血屏障（marrow blood barrier，MBB）作为骨髓中成熟血细胞、外周血中的造血干细胞以及其它物质出入骨髓所必须经过的通路，是白血病细胞由骨髓入血的屏障，白血病时其调节机制究竟发生了那些变化？相关文章报道较少。二十年来，大量研究证实，血管新生在恶性肿瘤的生长、浸润、转移过程中起着重要作用。血管新生受多种特异性调控因子的影响，包括血管内皮生长因子（vascular endotheliai cell growth factor。VEGF），碱性成纤维细胞生长因子（bovine basic fibroblast growth factor，bFGF），肿瘤生长因子等［1］。Thomas等［2］认为，粘附分子在正常造血调节中起重要作用，造血祖细胞、细胞基质与内皮细胞之间的相互作用决定了造血细胞是否从骨髓微环境中释放。为此，本课题通过检测 VEGF、bFGF、sICAM－1及CD105在白血病的表达情况，探讨白血病时血管新生调控因子对髓血屏障调节机制的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 本院初诊未治白血病患者61例，男38例，女23例，中位年龄41（12－85）岁。急性淋巴细胞白血病（ALL）14例（T－ALL3例，B－ALL11例），急性髓系白血病（AML）35例（M12例，M212例，M36例，M43例，M512例）和慢性粒细胞白血病（CML）8例；慢性淋巴细胞白血病（CLL）4例；其中，外周血白细胞＞100×109／L为高白细胞白血病组（52例），＜100×109／L低白细胞白血病组（9例，其中T－ALL2例，M21例，M34例 ，M52例，）；所有病例符合MICM诊断标准。正常对照组20例，为查体健康者，男16例，女4例，中位年龄32.5岁。

1.2 抗凝骨髓液及骨髓涂片制备 取骨髓液2 ml，一份注入含5%EDTA干粉管抗凝，标本在30 min内2000r／min，分离10min，吸取上层液，置－80℃冻存。一份滴至多聚赖氨酸处理的玻片上，制备新鲜涂片2张，并及时用4%多聚甲醛／0.MPBS（pH7.2－7.6），含 1／1000DEPC（抑 制 RNA 酶 对mRNA的分解）的固定液固定30分钟，蒸馏水充分洗涤，干燥后－20℃保存。

1.3 方法 （1）CD105原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，用于检测骨髓涂片标本的CD105的mRNA序列，针对人的CD105靶基因的 mRNA 序 列 为 ①5’－TTCT CATGC TGGAA GCCAG CCAGG ACATG GGCCG－3’；② 5’－CATCG ACGCC AACCA CAACA TGCAG ATCTG GACCA－3’；③5’－TCCAG ACAAA GTGTG CCGAC GACGC CATGA CCCGA－3’；严格按照试剂盒说明书进行操作，结果判定阳性细胞胞浆着色为棕黄色颗粒状，在光学显微镜下随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞。计算阳性细胞百分率。（2）VEGF、bFGF、sICAM－1酶联免疫吸附测定（enzyme linked－lmmunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，严格按试剂盒说明书进行操作。用自动酶标分析仪读取吸光度（A）值，根据ELISA实验所得的标准品的A值，相应浓度，应用Curve Expert 1.3软件绘制标准曲线，分别求得骨髓液 VEGF，bFGF，sICAM－1浓度。

1.4 统计学分析 所有数据处理采用SPSS 11.5统计软件处理。实验数据均以均数±标准差（±S）表示，采用t检验，直线相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD105在不同类型白血病的表达 CD105在白血病的表达以急性髓系白血病（AML－M5）最高，急性髓系白血病（AML）AML－M3表达最低。AML－M5的阳性表达率为［（52.32±15.34）%］明显高于正常对照组 ［（2.32±0.87）%］（P＜0.05）；AML－M3的阳性表达率为 ［（3.56±1.21）%］与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；CLL阳性表达率与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；其他白血病（T－ALL、B－ALL、M1、M2、M4、CML）的阳性表达率均明显高于正常对照组（P＜0.05）；CD105在高白细胞白血病组的表达明显高于在低白细胞白血病组的表达（P＜0.05）；结果见表1；部分白血病阳性结果如图1－6示。

图1－6 分别为T－ALL、B－ALL、AML－M3、AML－M5、CML、CLL

表1 不同白血病分组CD105的表达

2.2 不同类型白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sI－CAM－1含量 骨髓液VEGF、sICAM含量在CML表达最高，bFGF在 B－ALL表达最高，VEGF、sICAM而含量在T－ALL明显高于与正常对照组（P＜0.05）；bFGF含量在 T－ALL与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；CLL表达 VEGF、bFGF与正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；CLL表达sICAM明显高于正常对照组；其他白血病（BALL、M1、M2、M3、M4、M5、CML）VEGF、bFGF、sICAM均明显高于正常对照组（P＜0.05）；VEGF、sICAM在高白细胞白血病组的表达明显高于在低白细胞白血病组的表达（P＜0.05）；而bFGF在高白细胞白血病组与低白细胞白血病组的表达无明显差异（P＞0.05）。结果见表2。

表2 不同白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sICAM－1的表达情况（±S，ng／L）

表2 不同白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sICAM－1的表达情况（±S，ng／L）

注：与正常对照比较：P＜0.05，＊P＞0.05；高、低白细胞组比较：#P＜0.05，##P＞0.05。

VEGF bFGF sICAM－1 T细胞型 3 185.63±38.12＊ 8.50±5.41 175.51±76.52组别 例数＊20 111.23±73.28 7.33±3.21 159.62±48.89 B细胞型 11 460.20±143.35 32.35±17.65 497.56±154.12 M1 2 283.54±58.32 16.57±7.58 458.62±195.34 M2 12 321.33±78.66 18.42±9.87 386.79±154.37 M3 6 356.74±113.50 26.10±13.46 285.69±132.62 M4 3 376.57±83.64 21.67±12.65 426.87±186.70 M5 12 485.36±143.21 22.73±11.79 563.45±198.61 CML 8 528.35±137.67 28.56±18.46 587.62±147.29 CLL 4 122.32±61.65＊ 9.54±6.15＊ 487.69±167.54高白细胞组 52 398.77±127.18# 19.46±13.67## 532.37±176.93#低白细胞组 9 216.73±62.47 20.36±7.83 228.56±98.92正常对照组

2.3 CD105与 VEGF、bFGF、sICAM 的表达的相关性分析 骨髓液CD105在AML－3的表达与VEGF、bFGF、sICAM的表达呈负相关。在其他类型白血病与VEGF、bFGF、sICAM 的表达呈正相关。

3 讨论

MBB的功能单位是髓窦，它是由连续的内皮层，间断的基膜层和外膜层构成，髓窦联络成网，埋在纤维母细胞基质内。髓窦之间是造血组织，髓窦的内皮层是由一层连续排列的内皮细胞构成窦腔。基膜是由内皮细胞外基质构成。外膜层是由广泛间断地覆盖在内皮层外面的外膜细胞构成，属纤维母细胞。其覆盖程度称外膜细胞覆盖率（ACCR）。ACCR参考值为60～65%［4］。关于血细胞出髓的机制十分复杂，既与MBB的结构特点有关，也和造血微环境的生化变化及各种造血调控因子的作用密切相关。

研究证实血管新生在恶性肿瘤的生长、浸润、转移过程中起着重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）是一种血管内皮细胞特异的分裂原，能特异地刺激内皮细胞的分裂与增殖，促进血管的生长。bFGF是成纤维细胞生长因子（FGF）超家族成员，为重要的血管生成因子，它可以刺激内皮细胞的增生和迁移，从而促进肿瘤血管生成［4］；Dias［5］等证实白血病分泌的bFGF可引起内皮细胞释放VEGF，VEGF与bFGF有协同作用。国外大量实验均证实，CD105在新生的内皮细胞上强表达，是内皮细胞增殖的标志之一［6］。在白血病的发生过程中，粘附分子的数量和亲和力的变化起重要作用，粘附分子的相互作用促进了白血病细胞的增殖。同时粘附分子可以改变白血病细胞的生物学行为，导致其浸润和扩散的发生［2］。

本研究结果显示骨髓液CD105、VEGF、bFGF、sICAM 在B－ALL、M1、M2、M4、M5、CML均存在较高表达，临床上大多数白血病骨髓中高增殖的白血病细胞与外周血白血病细胞往往呈现正相关。Nagaoka T［7］使用透射电镜在各种白血病时，其外周血中的白细胞增高则除与骨髓腔内无限增殖的白血病细胞所导致的髓腔压力增高，使隔膜孔扩大易于突破髓血屏障等之外，还与外膜细胞覆盖率明显减低有关。原因可能为肿瘤血管生成的调节是一个复杂的网络，是这些细胞因子相互作用，影响了髓血屏障的结构及调节机制，CD105与VEGF高表达刺激内皮细胞分裂和增殖，bFGF高表达刺激纤维母细胞的生长，刺激内皮细胞增生和迁移，两者的表达量的平衡影响髓血屏障内皮层内皮细胞与外膜层纤维母细胞数量的平衡，影响着髓血屏障外膜覆盖率，影响着出髓细胞的数量。所以，外周血中白细胞数增高机制除与白血病细胞无限增殖、白血病性干细胞的髓外增殖有关外，还与髓血屏障的严重受累有重要关系。

在 AML－3，CD105与 VEGF、bFGF、sICAM 的表达成负相关，CD105呈低表达，VEGF、bFGF、sICAM呈较高表达，临床常常表现为骨髓增生极度活跃而外周血表现全血细胞减少，可能为髓血屏障内皮层内皮细胞与外膜层纤维母细胞数量的平衡未被完全打破所致。

在B－ALL CD105、VEGF、bFGF、sICAM 的表达水平均位于高值，而在T－ALL CD105、VEGF的表达较正常增高，而bFGF得表达与正常无明显差别，而临床上T－ALL往往表现高白细胞血症和纵膈及其他组织的肿块，可能与CD105、VEGF增高，bFGF正常表达，致使血管生成在髓血屏障的调节平衡被打破，触发白血病细胞生长、浸润和转移。B－ALL临床往往表现骨髓液流动性差、粘稠而不易抽取，推测原因可能为CD105、VEGF、bFGF、sICAM平行性增高，使血管生成与抗血管生成的平衡未被完全破坏，相对高增殖的白血病细胞，未有足够的血管供应造成。在CLL CD105、VEGF、bFGF的表达与正常对照无明显差别，而sICAM表达较高，临床上骨髓CLL白血病细胞与外周血白血病细胞往往呈现一致性，可能为成熟淋巴细胞分泌CD105、VEGF、bFGF的量少有关。而sICAM的升高，竞争性的结合细胞表面受体，因而使细胞间粘附减少，使骨髓的白血病细胞释放到外周血的细胞数量升高。

bFGF在高白血病组与低白血病组的表达量无明显差异，推测原因可能为，bFGF在不同白血病的分泌量比CD105与VEGF、sICAM的分泌量低有关。但通过bFGF在 AML－M3、T－ALL、CLL的表达情况看，bFGF对髓血屏障有着较为重要的作用，与调节白血病细胞出髓有重要的关系。

总之，研究表明不同白血病患者存在不同程度的血管新生因子的异常表达，CD105、VEGF、bFGF、sICAM参与构成了骨髓内的诱导微环境，影响造血细胞的粘附、增殖和分化，影响髓血屏障的结构和调节机制，使髓血屏障调节平衡被打破，触发白血病细胞生长、浸润和转移，在调节造血系统的生长、分化及细胞出髓、入髓中起重要作用。

［1］Kerbel R，Folkman J.Clinical translation of angiogenesis inhibitors［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（10）：727.

［2］Thomas X，Anglaret B.Cell adhesion molecules：expression and function in acute myeloid leukemia［J］.Bull Cancer，1999，86：265.

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［4］张志宏，杨崇礼.血液病造血组织病理学图谱［M］.湖南：湖南科学技术出版社，1988：2－3.

［5］Dias S，Choy M，Alitalo K，et al.Vascular endothelial growth factor（VEGF）－C signaling through FLT－4（VEGFR－3）mediates leukemic cell proliferation。survival.and resistance to chemotherapy［J］.Blood，2002，99（6）：2179.

［6］Wikstrom P，Lissbrant LF，Statin P，et al.Endoglin（CD105）is expressed on immature blood vessels and is mare for surrival in prostate cancer［J］.Prostate，2002，51（5）：268.

［7］蓝丰硕 综述，林果为 审校.髓血屏障及其调节［J］.国外医学·输血及血液学分册，1993，16（1）：11.