大肠癌组织Runx3基因启动子甲基化的研究

西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤科（西安710061）

徐 瑞△＃ 刘 伟＊ 李丽娜＃

Runx3基因是近年来在胃癌中发现的抑癌基因［1］，据报道至少40%的胃癌组织中Runx3基因启动子区高甲基化，此种高甲基化状态直接导致基因静默，表达缺失［2］。Runx3基因启动子甲基化具有很高肿瘤特异性，有望成为胃癌诊断的早期标记。Runx3基因是否在大肠癌的发病中起重要作用，目前尚不完全清楚。本研究中我们检测了大肠癌中Runx3基因的表达和启动子区甲基化状态，探讨Runx3基因启动子甲基化与Runx3抑癌基因失活的关系及其对结肠癌发生发展的影响和意义。

材料与方法

1 组织标本 收集陕西省肿瘤医院2009年8月至2010年12月期间手术切除的37例大肠癌组织及癌旁组织标本，其中男21例，女16例，年龄35～75岁。病例均经过2名病理科医生确定诊断。置于液氮中速冻，-80℃保存备用。

2 细胞培养 结肠癌细胞系HT29、HCT1116为本院所保存，用含10%小牛血清的Ma COY’s 5 A完全培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。甲基转移酶抑制剂5-aza-d C购自Sig ma公司，终浓度为5μM的5-aza-d C处理结肠癌细胞系72h，等体积的DMSO处理细胞作为溶剂对照。

3 DNA和RNA的提取 取备用的大肠癌标本约20μg研磨成粉，利用Ta Ka Ra公司的基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书提取组织和细胞DNA，并测定其纯度和浓度备用。

RNA的提取利用天根公司RNA提取试剂盒，按照说明书提取总RNA并测定其纯度和浓度，利用Ta Ka Ra公司的反转录试剂盒获得c DNA用于PCR模板。

4 Real time PCR 引物序列［3］为：Runx3上游5′CAGAAGCTGGAGGACCAGAC3′，下游5′GTCGGAGAATGGGTTCAGTT3′，扩增 产物为180bp；GAPDH 上游 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′，下游 5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′，扩增产物为138bp。逆转录合成cDNA后，利用IQ5进行Real time PCR扩增，反应条件为95℃预变性60s，变性5s，62℃退火延伸30s，40轮循环，自动设置熔解曲线。每个样本设3个复孔。利用IQ5分析系统分析每个样本基因表达强度，以各自GAPDH表达值为参考。

5 MSP分析Runx3基因甲基化状态 甲基化特异PCR（MSP）：①重硫酸氢盐修饰：取 DNA约1μg，加入终浓度0.3 mol／L的Na OH中，37℃水浴30 min；3.9mol／L亚硫酸氢钠（PH5.0）520μl与10mmol／L对苯二酚30μl混合，加入碱变性后的DNA 50μl，覆盖矿物油，55℃水浴18h。②模板DNA纯化：经过碱基修饰的DNA用Wizard DNA纯化试剂盒纯化。0.3mol／L Na OH与纯化DNA反应去除硫化基团，乙酸钠、乙醇沉淀DNA，去离子水重悬，-20℃保存。③PCR扩增：采用Runx3基因特异的甲基化引物和非甲基化引物对修饰后的DNA进行扩增［4］。PCR反应总体积20μl，模板 DNA 2μl，10μmol／L上下游引物各1μl，10 mmol／Ld NTP混合物1μl，热启动 Taq酶1 U。98℃变性45s，63℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10 min。双蒸水代替DNA进行PCR作阴性对照。2%琼脂糖凝胶中电泳。

6 统计学处理 本组采用SPSS13.0统计软件包对所有数据进行统计分析 ，计数资料比较采用卡方（χ2）检验，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 Runx3基因mRNA水平在大肠癌组织中的表达 见图1。Real time PCR检测37例大肠癌及对应癌旁组织中Runx3基因的表达水平，结果显示：大肠癌中Runx3基因表达的平均水平为1.787±0.252，低于癌旁组织中的平均表达水平（14.33±1.236）。二者具有极显著性差异（P＜0.01）。

图1 Runx3基因在大肠癌及癌旁组织中mRNA水平的相对表达水平

2 Runx3基因启动子区甲基化在大肠癌中的检测 见图2～3。利用甲基化特异性PCR检测大肠癌组织中Runx3基因启动子区甲基化状况。37例大肠癌组织中11例有甲基化产物，甲基化阳性率为30%，而仅1例癌旁组织检测到甲基化产物，甲基化阳性率为2.7%，二者比较具有极显著性差异（P＜0.01）。另外，在结肠癌细胞系HT29和HCT116中检测Runx3基因甲基化状况，结果显示：HT29呈完全甲基化状态；而HCT116细胞系中该基因呈非甲基化状态。

3 甲基转移酶抑制剂5-aza-d C能够使Runx3基因表达复活 见图4。Runx3基因在正常结肠黏膜组织及结肠癌细胞系HCT116中正常表达，而在结肠癌细胞系HT29中均表达静默。经过去甲基化药物5-azad C处理上述结肠癌细胞系后，发现Runx3基因在HT29细胞中表达明显复活，而在HCT116中Runx3基因表达不受影响。

图2 Runx3基因启动子MSP检测结果及测序图M甲基化扩增产物；u非甲基化扩增产物；T大肠癌组织；N癌旁组织

图3 Runx3基因甲基化水平

图4 5-aza-d C处理细胞系后Runx3基因表达变化

讨 论

既往报道显示：Runx3基因为抑癌基因，在胃癌组织中处于失活状态。机制研究显示其失活机制为杂合性缺失和启动子高甲基化［5］。因Runx3基因高甲基化具有高度的肿瘤特异性，有望成为胃癌早期诊断的生物学标志，故已成为国内外研究的热点。国外已对胃癌、胰腺癌、胆管癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌等作了研究，均发现不同程度Runx3基因启动子甲基化，尤其与消化系统组织来源肿瘤密切相关，但是国内没有在大肠癌中研究Runx3基因甲基化的系统报道。既往许多研究发现TGFβ途径的异常在大肠癌发生发展中发挥重要作用，故我们推测作为TGFβ途径关键基因的Runx3也参与大肠癌的发生。

本实验结果提示：Runx3基因在大肠癌组织的表达水平明显高于癌旁组织中。这种表达的差异说明Runx3基因在大肠癌中的表达降低与大肠癌的发生有关。同时，我们探讨这种表达降低的机制发现30%的大肠癌组织中Runx3基因甲基化，甲基化比例与Goel等报道的比例相似［6］，Runx3基因甲基化可能是导致其表达沉默的原因之一，可能参与了大肠癌的发生。此结果与国外学者在肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌中所发现的Runx3甲基化存在肿瘤特异性的结果一致，推测Runx3甲基化有可能成为肿瘤诊断标记。研究发现在1例癌旁大肠黏膜组织中检测到甲基化产物，这可能与患者年龄大有关。既往日本学者也曾经发现Runx3基因甲基化与人类的衰老存在明显的相关性。

DNA甲基化是表观遗传修饰的一种重要方式，是一个可逆的过程。实验研究中最常用到的甲基转移酶抑制剂5-aza-d C，它通过抑制DNA甲基转移酶的活性达到去甲基化的作用。为了研究Runx3基因甲基化敏感性，本研究中采用两种结肠癌细胞系，结果发现在HT29细胞中Runx3呈高度甲基化状态，5-aza-d C处理后，Runx3表达复活。这说明DNA甲基化在转录水平抑制Runx3基因表达，进而减少蛋白的合成。Runx3蛋白下调可能使TGFβ途径生长抑制作用减弱，形成肿瘤。

本研究结果显示：Runx3基因在大肠癌中的表达下降，DNA甲基化研究检测发现Runx3基因在大肠癌中处于高甲基化状态，提示其可能是Runx3基因下调的机制之一。由此可见Runx3基因甲基化沉默在大肠癌的发生发展中可能有一定的作用。至于其在大肠癌的早期诊断、疗效检测和预后评估中的价值及其能否作为大肠癌生物学标志仍需进一步的证实。

［1］Ito K，Liu Q，Salto-Tellez M，etal.Runx3，a novel t u mor suppressor，is frequently inactivated in gastric cancer by pr otein mislocalization［J］.Cancer Res，2005，65（17）：7743-7750.

［2］Ho mma N，Tamura G，Honda T，etal.Spreading of methylation wit hin Runx3 Cp G island in gastric cancer［J］.Cancer Sci，2006，97（1）：51-56.

［3］Cheng CK，Li L，Cheng SH，etal.Transcriptional repression of the Runx3／AML2gene by the t（8；21）and inv（16）f usion proteins in acute myeloid leukemia［J］.Blood，2008，112（8）：3391-3402.

［4］Kato N，Tamura G，Fukase M，etal.Hyper met hylation of t he Runx3 gene pro moter in testicular yolk sac t u mor of infants［J］.Am J Pathol，2003，163（2）：387-391.

［5］Li QL，Ito K，Sakakura C，etal.Causal relationship bet ween the loss of Runx3 expression and gastric cancer［J］.Cell，2002，109（1）：113-124.

［6］Goel A，Arnold CN，Tassone P，etal.Epigenetic inactivation of Runx3 in microsatellite unstable sporadic colon cancers［J］.Int J Cancer，2004，112（5）：754-759.