口腔真菌感染31例两种检测方法对比

西安交通大学口腔医院检验科（西安710004）

牛 洁 黄 萍△ 苗群爱▲ 陈 鑫

随着现代医学技术的发展，介入性检查治疗手段的广泛应用，肿瘤放化疗、器官移植术后、社会老龄化及慢性疾病患者增加等因素，引起免疫功能低下人群的比例增高，特别是近年来大量新的、高效广谱抗生素的临床应用，使真菌感染日益增加，不但在医院感染中越来越重要，成为重要的病原菌，而且使内脏、皮肤、黏膜被真菌感染者日益增多，真菌的临床检出率明显增加，已占各类标本总检出感染源的10%以上［1］。

在我院以口腔黏膜病前来就诊的患者也有增加的趋势，已引起临床的广泛关注。真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，随着真菌感染病例的日益增多，对实验室的诊断也提出了更高的要求。我院于2010年10月至2011年8月对31例疑似口腔真菌感染患者，进行黏膜标本检测法和唾液标本检测法对比分析，旨在找出检测口腔真菌感染的最佳方法，为临床减少漏诊、误诊率以及真菌感染的确诊提供更为准确的实验室参考依据。

资料与方法

1 临床资料 选择在西安交通大学口腔医院黏膜科就诊患者31例，其中男16例，女15例，年龄17～86岁，平均61岁。男性假膜型1例、红斑型13例、肥厚型2例；女性假膜型1例、红斑型13例、肥厚型1例。患者入选标准以临床诊断为主要依据进行筛选。对照组11例，其中男6例，女5例，年龄21～83岁，平均58岁。排除服用皮质激素或其他免疫抑制药物、服用抗真菌药物、糖尿病病人和HIV阳性者。

2 检测试剂 沙保罗琼脂由温州康泰生物公司生产；假丝酵母菌显色平板由郑州安图生物公司生产；10%KOH溶液由天津天力公司提供；快速革兰染色液由温州康泰生物公司提供；ATCC90028白假丝酵母菌由第四军医大学口腔医院检验科黄萍博士惠赠。

3 实验方法 实验操作均严格按照《全国临床检验操作规程》和试剂说明书进行。采集标本用一次性针管无菌采集患者唾液约0.5 ml，同时用一次性无菌拭子取病发或病损部位黏膜，范围为1.0c m2左右面积内，擦拭5次。

3.1 黏膜标本检测法：用于检测采集的病发或病损部位黏膜。将采集的标本置于载玻片上，加1滴10%KOH溶液，然后盖上盖玻片并微微加热，在显微镜下镜检有无孢子或菌丝。以检见孢子或菌丝为阳性；将采集的病发或病损部位黏膜标本接种在沙保罗培养基上，37℃培养24～48h，将生长的菌落镜检确定为真菌后接种于假丝酵母菌显色平板上，经37℃培养24～48h进行菌种鉴定。若菌种超出假丝酵母菌显色平板外则归为其它真菌。ATCC90028白假丝酵母菌作为阳性对照。

3.2 唾液标本检测法：采集唾液标本进行革兰染色后镜检，显微镜下若见到革兰阳性圆形或卵圆形菌体或检见菌丝即为阳性。同时将唾液标本0.1 ml进行培养与鉴定（培养与鉴定方法同黏膜标本检测法）。

4 统计学处理 本组采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，计量资料组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 两组涂片检测阳性率比较 见表1。用黏膜标本检测的31例标本中，3例镜检为阳性，阳性率为9.67%；用唾液标本检测的31例标本中，5例镜检为阳性，阳性率为16.12%，健康对照组黏膜及唾液标本均为阴性。

表1 两组直接涂片镜检检测结果

表2 两组真菌培养与鉴定结果

2 两组真菌培养与鉴定结果 见表2。黏膜及唾液培养鉴定组中，健康对照组黏膜标本均无菌生长，唾液标本10例无菌生长，1例菌落数为2个，平均0.18±0.60个，经鉴定为白假丝酵母菌。31例黏膜标本检出白假丝酵母菌9例，热带假丝酵母菌1例，阳性率共计32.25%，在检出假丝酵母菌的10例阳性者中，平皿菌落数在4～10个之间，平均1.94±3.22个；31例唾液标本检出白假丝酵母菌20例，热带假丝酵母菌2例，阳性率为70.96%；平皿菌落数在6～22个之间，平均7.19±5.71个。均明显高于健康对照组菌落数。本实验均未检出其它假丝酵母菌。统计生长的菌落数，唾液标本与黏膜及健康对照组有非常显著性差异（P＜0.01）。

讨 论

口腔假丝酵母菌病的临床诊断主要依靠病史和临床表现。但要确诊，就必须依靠实验室检查，证实损害中存在病原菌。因此实验室在为临床提供有效性、准确性和时效性的客观指标方面负有无可推卸的责任。实验室真菌培养与鉴定在确定感染的发生和性质，为临床真菌感染性疾病的诊断及治疗提供准确的依据就显得尤为重要。

本组对31例疑似口腔真菌感染的患者通过不同标本取材，不同方法涂片镜检及真菌培养与鉴定，得到不同的阳性率。虽然直接涂片法这类最传统的检测方法简便易行，操作成本低，但阳性检出率低。徐岩英等认为，涂片法和培养的结果有较大的误差［2］；张利侠等也认为不同的实验方法其敏感性和特异性差别很大，实验受多种因素的影响，如病人选择和实验操作等［3］，而且涂片法不能进行菌种的鉴定，不利于临床对症治疗。鉴于以上原因，建议临床尽可能不使用涂片法作为口腔感染真菌的诊断依据。

由于大部分真菌是在大量使用抗生素等导致机体免疫功能下降，在其合适的条件下大量繁殖成为条件致病菌，而过度使用或滥用抗真菌药物又会导致真菌耐药性的增加，因此真菌感染通常比细菌感染的治疗更困难。也导致近年来由真菌引起的疾病发病率呈逐年上升趋势［4］。而且不同假丝酵母菌的致病机制、所引起的临床症状、所产生的毒素种类、毒力大小均不相同，以及对抗真菌药物的敏感性也不相同。为了使临床医生在抗真菌药物种类的选择和使用剂量上更为合理、更为科学，临床上迫切需要微生物检验把真菌鉴定到种的水平［5］。因此，重视真菌种类的鉴别具有特殊意义。

虽然健康人口腔内存在假丝酵母菌，但它们和口腔中的其他正常微生物一起，形成了一个完整的生态体系，维持口腔中的生态平衡［6］，免疫系统的完整性能有效控制假丝酵母菌的感染［7］，无论是健康对照组还是口腔真菌感染者其唾液都是他们口腔内环境的真实表达。本组将唾液直接接种于沙保罗琼脂上，31例患者中22例有菌落生长，菌落数为6～22个。所有无病损者菌落数为0～2个。说明此方法受到口腔正常寄生菌群的干扰很小，根据菌落数值其越高表示样品中所含的细菌越多，提示与疾病的发生越相关。

目前针对口腔中假丝酵母菌的研究比较多，但是检出率并不一致，除了不同疾病导致的口腔环境的差异外，取样和检测的方法不一致也是比较重要的原因。缺乏统一有效的方法，而检出结果直接受到方法的影响，得出的结果难以进行有效的分析比较［8］。可见选择合适的标本和方法非常重要。本研究结果显示：唾液是理想的检测选择标本，将患者唾液进行真菌培养鉴定，标本便于采集，结果容易判断，是最为简便有效的口腔真菌感染鉴定检测方法。

［1］刘永仙，刘晓斌，王亚萍，等.临床感染标本1100份真菌鉴定结果及耐药性分析［J］.陕西医学杂志，2005，35（3）：370-371.

［2］徐岩英，胡碧琼.口腔念珠菌病诊断的研究［J］.中华口腔医学杂志，1993，28（6）：368-371.

［3］张利侠，归巧娣，刘 波，等.深部真菌感染实验室诊断技术研究进展［J］.陕西医学杂志2009，38（5）：620-621.

［4］吴爱武.院内感染标本分离的260株念珠菌调查与分析［J］.上海医学检验杂志，2000，15（3）：172-173.

［5］Willia ms DW，Lewis MA.Isolation and identification of Candida fro m the oral cavity［J］.Oral Dis，2000，6（1）：3-11.

［6］Cannon RD，Chaffin WL.Oral colo-nization by Candida albicans［J］.Crit Rev Oral Biol Med ，1999，10（3）：359-383.

［7］Ash man RB，Farah CS，Wanasaengsakul S，etal.Innate versus adap tive i mmuni-ty in Candida albicans infection［J］.Immunol Cell Biol，2004，82（2）：196-204.

［8］亓庆国，周学东，肖晓蓉，等.影响正常口腔念珠菌检出率的方法学研究［J］.中国微生态学杂志，2004，16（1）：29-30.