冠心病痰证与载脂蛋白A5c.553G＞T基因多态性的关系研究1）

聂 娅，周小青，兰红勤，黎鹏程，郭春秀

冠心病发病与多种易感基因有关。痰证是冠心病临床常见的中医证型，但有关冠心病痰证与APOA5c.553G＞T基因多态性的相关性研究尚未见报道。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 冠心病诊断符合1979年WHO制定的缺血性心脏病诊断标准。痰证辨证标准：参考《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》（GB／T16751-2-1997）。非冠心病痰证主要选择慢性支气管炎、高血压、高脂血症等痰证病人。西医诊断参照国际国内相关疾病诊断标准。健康对照组选择性别、年龄与冠心病组相匹配者，经病史询问无冠心病，体格检查无阳性体征，心电图、动态心电图或运动心电图未提示心肌缺血证据，胸部X片、肝肾功能、血尿常规检查均无异常者。

1.2 研究对象 选择2008年6月—2010年6月在湖南中医药大学附属第一医院住院及体检中心体检者。256例入选对象均为湖南地区无血缘关系的汉族人群，分为4组：①冠心病痰证组58例，年龄（63.86±9.32）岁，男39例，女19例；②冠心病非痰证组51例，年龄（63.04±8.80）岁，男33例，女18例；③非冠心病痰证组73例，年龄（62.37±6.58）岁，男52例，女21例；④健康对照组74例，年龄（62.19±6.63）岁，男44例，女30例。4组年龄、性别经分析无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.3 研究方法

1.3.1 主要仪器和试剂 PE480型PCR仪，M-15E紫外透射仪，Palariod摄影机。TaqDNA 聚合酶、RNAse、PUC18DNA／MspI、λDNA／hindⅢ、溴乙淀（北京天根生化科技有限公司），HaeⅢ内切酶（Fermentas）。

1.3.2 血样采集 所有被检者空腹12h后，于次日08：00测量身高、体重、血压，并计算体质量指数（BMI）。采集静脉血5 mL，其中2mL以2%EDTANa2抗凝，用于抽提基因组DNA。其余3mL于当日检测血脂。

1.3.3 血脂检测 采用酶法测定总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG），采用化学遮蔽法直接测定高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）。以上检测均在德国罗氏公司 MODULAR PP全自动生化分析仪上进行。

1.3.4 基因组DNA提取 采用十二烷基硫酸钠及蛋白酶K消化，酚／氯仿提纯，乙醇沉淀。

1.3.5 引物设计与合成 参考文献［1］设计，正向引物5′-AGA CAC CAA GGC CCA GTT GCT GGG-3′；反向引物5′-ATG CCG CTC ACC AGG CTC TCG GCG-3′。由上海英骏生物技术公司合成。

1.3.6 PCR反应及限制性片段长度多态性分析 PCR反应总体系20.0μL：dd H2O 14.2μL，PCR Buffer（含 Mg2）2.0μL，dNTPs 0.5μL，正向引物、反向引物各0.5μL，DNA模板2.0 μL，DNA聚合酶0.3μL。PCR反应条件：96℃预变5min；96℃变性30min；58℃退火30s；72℃延伸30s，循环35次；末次循环后72℃延伸7min，最后保存于4℃。取PCR产物10.0 μL，以HaeⅢ限制性内切酶1.0μL，37℃水浴5h。酶切产物经含EB的3%的琼脂糖凝胶电泳检测，90V恒压电泳1h，紫外灯下判断结果并拍照记录。并随机抽取部分PCR产物送南京金斯特生物技术公司测序。

1.4 统计学处理 使用SPSS13.0分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析、LSD、Tamhane’s法。对符合正态分布的两独立样本均数间比较用独立样本t检验。不符合者用t’检验。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度。计数资料使用卡方检验。相关基因型、危险因素与CHD痰证的相关性用Logistic回归分析。

2 结 果

2.1 研究对象临床资料 各组在年龄、性别、吸烟史上无统计学意义，病例组与对照组具有可比性。CHD痰证组的BMI高于其他3组（P＜0.01），非CHD痰证组BMI明显高于健康对照组（P＜0.01）；健康对照组收缩压、舒张压明显低于其他3组（P＜0.01）；健康对照组TG明显低于其他3组（P＜0.01），CHD痰证组LDL-C高于健康对照组（P＜0.01），这些数据进一步肯定了这些危险因素对CHD发病的重要影响。详见表1。

表1 4组临床资料比较

2.2 APOA5c.553G＞T基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验 256例受检者中，c.553G＞T位点GG型221例（86.33%），GT型35例（13.67%），TT型0，G等位基因频率93.16%，T等位基因频率6.84%，经卡方检验，本研究中APOA5c.553G＞T基因型分布频率的实际值与预计值差异不显著（χ2=1.378，P=0.240），符合Hardy-Weinberg平衡。说明样本来自一个较大的、处于随机婚配平衡状态的群体，具有一定代表性。

2.3 4组APOA5c.553G＞T基因多态性分布 4组相比，APOA5c.553G＞T多态性基因型及等位基因分布均无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 4组APOA5c.553G＞T基因多态性分布

2.4 APOA5c.553G＞T不同基因型的血脂水平 对全部受试者APOA5c.553G＞T位点不同基因型的血脂水平进行比较，两型间血清TG水平差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表3。

表3 全体对象c.553G＞T位点不同基因型间血脂水平（x±s）

2.5 APOA5c.553G＞T不同基因型与冠心病痰证发病风险的关系 首先根据病例-对照研究计算CHD痰证组与健康对照组间不同基因型的OR值，再将不同组别作因变量、以c.553GT、c.553GG、性别、年龄、吸烟史、舒张压、收缩压、BMI、血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）为自变量，进行Logistic回归分析。结果显示，c.553T等位基因携带者发生冠心病痰证的风险比野生型GG携带者增加了3.600倍，但在校正了年龄，性别、吸烟史、舒张压、收缩压、BMI、血脂等因素后，未显示c.553GT是冠心病痰证的独立危险因素。详见表4。

表4 APOA5c.553G＞T不同基因型与冠心病痰证发病风险的关系

3 讨 论

载脂蛋白是一类具有脂类转运功能的血浆蛋白质，其结构与合成异常将影响血脂代谢，而血脂异常是动脉粥样硬化和冠心病发生的重要危险因素。载脂蛋白 A5是2001年［1］在ApoA1／C3／C4基因簇中发现并证实的一个载脂蛋白家族新成员，ApoA5基因多态性与心脑血管疾病及代谢性疾病有一定关联性且存在种族差异［1-3］。ApoA5基因存在13个单核苷酸多态位点，其中ApoA5c.553G＞T是由Kao等［2］发现，该多态性是由于基因编码区第553位的碱基G突变为T，使第185位甘氨酸（glycine，G）转变为半脱氨酸（cysteine，C），进而可能影响了蛋白功能。在本研究的256例受检者中，c.553G＞T位点GG型221例（86.33%），GT型35例（13.67%），TT型0例，G等位基因频率93.16%，T等位基因频率6.84%，符合Hardy-Weinberg平衡。该多态位点的突变等位基因T的频率相当低（在健康人群中仅为3.38%），本实验中未发现1例TT型，可能与样本大小及样本本身差异有关，与Kao等［2］以及其他关于中国人群的报导相似［4-6］。而在白种人群中的报导结果T等位基因的频率尚缺如［7］，因此该多态位点的分布亦有明显的种族差异。

ApoA5c.553G＞T多态性与高 TG血症有关［1，4，5］，但也有研究认为，除了与高TG血症有关外，还与LDL-C升高或HDLC降低有关［4，6］。而本研究表明，c.553TG型血清TG水平明显高于GG型（P＜0.01），而血清TC、LDL-C和HDL-C水平则没有显著差异。

本研究结果表明，冠心病痰证组与健康对照组相比，ApoA5c.553G＞T在基因型和等位基因频率分布两方面均有统计学意义。c.553T等位基因携带者发生冠心病痰证的风险比野生型GG携带者分别增加了3.600倍，但在校正了年龄，性别、吸烟史、舒张压、收缩压、体质量指数、血脂等因素后，未显示c.553GT是冠心病痰证的独立危险因素，这一结果可能与样本量有限以及c.553T等位基因本身分布频率太低有关，因此，ApoA5c.553G＞T基因变异作为冠心病痰证的独立危险因素尚需更大样本人群研究证实。

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