副猪嗜血杆菌OMP2基因的克隆及蛋白结构预测

刘 建，汤德元*，罗险峰，曾智勇，李春燕，甘振磊，王 凤，郝 飞，王洪光

（ 1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008）

副 猪 嗜 血 杆 菌（Haemophilus parasuis，HPS）是健康猪上呼吸道常见的一种细菌，主要定植在鼻黏膜和（或）扁桃体区域[1]，在受到外界刺激下，HPS 可以突破鼻黏膜的屏障迁移到肺部，造成肺炎，而且会进一步的传播导致严重的全身性疫病，主要以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为特征，咬肌炎较少见[2-3]，这种病被称为副猪嗜血杆菌病或格拉泽氏病。副猪嗜血杆菌只感染猪，主要发生在断奶前后和仔猪阶段，多见于5～8 周龄的仔猪，一些应激因素，如长距离运输，恶劣的饲养的环境以及哺乳仔猪断奶过早等，对副猪嗜血杆菌的流行有一定影响[4]，该病发病率一般在10%～15%，严重时死亡率则高达50%[5]。HPS 是导致规模化养猪厂仔猪发病死亡的主要原因之一，在过去的几年里，给现代化养猪业造成了重大的经济损失[6]。外膜蛋白（Outer-Membrane Protein，OMP）、荚膜多糖、脂多糖、神经氨酸酶、转铁结合蛋白、毒素蛋白等都是HPS 的主要毒力因子[7]，均可导致机体发病。通过对完全获得HPS 免疫保护的动物研究发现，机体并未产生针对脂多糖和荚膜多聚糖的抗体，仅产生了具有中和外膜蛋白作用的抗体，证明外膜蛋白具有更强的免疫原性。本实验通过PCR 技术扩增HPS 的OMP2 基因，应用生物信息学软件对OMP2 基因及其编码的蛋白质进行结构及功能的分析，为研制检测 HPS 抗体的间接 ELISA 试剂盒以及 HPS 基因工程疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、感受态细胞和载体

副猪嗜血杆菌阳性病料采自贵州省安顺地区某规模化养猪场，经PCR 鉴定为阳性及间接血凝试验鉴定为血清型5 型后，-20℃保存；pMD18-T Vector 购自大连宝生物工程有限公司；基因工程菌E.coliTop10 感受态细胞，本实验保存。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer、Rnase Free H2O、BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ限制性内切酶、DL2000 DNA Marker、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；Amp、IPTG、X-gal 购于美国Sigma 公 司；GoldView 购于Hyclone公司；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit DNA 凝胶回收试剂盒和E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit 质粒提取试剂盒购自OMEGA 公司；琼脂糖，购自Biowest公司；其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.3 引物设计与合成

根据副猪嗜血杆菌SH0165株OMP2 基因序列(登录号：NC_011852)，用生物软件Premier Primer5.0 和Oligo6.0 软件设计1对特异性引物，扩增HPS OMP2 的全基因。引物序列如下：上游引物P1:5′-CGGGATCCATGAAAAAA ACACTAGTAGCA-3′ (下划线部分为BamHⅠ酶切位点)；下游引物P2:5′-GCGTCGACTTACCATAAT ACACGTAAACCA-3′(下划线部分为SalⅠ酶切位点)，预计扩增基因片段大小为1092 bp。引物由大连宝生物公司合成。

1.4 副猪嗜血杆菌OMP2 基因的扩增

用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 提取试剂盒提取副猪嗜血杆菌阳性病料基因组DNA，以此为模板，以P1 和P2 为引物，进行PCR 扩增。PCR 反应体系如下：10×PCR Buffer （含Mg2+）5μL、dNTP Mixture( 各2.5mM) 4μL、 上下游引物各2μL、Taq DNA 聚合酶1μL、DNA 模板4μL、加Rnase Free H2O 至总体积为50μL。PCR 反应条件 为：94℃预 变 性5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，共35 个循环，最后72℃延伸10 min。

1.5 副猪嗜血杆菌OMP2 基因的克隆与鉴定

将回收纯化的OMP2 基因与pMD18-T 载体连接，连接反应体系为：pMD18-T 载 体1μL、目的DNA 片 段3 μL 和Solution Ⅰ6 μL，16℃连接过夜，连接产物转化E.coliTop10 感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal 的2×YT 琼脂平板（含 氨苄青霉素50 μg/mL）上，37℃恒温培养12～16 h，挑取单个白色菌落接种于2×YT 液体培养基（含氨苄青霉素50μg/mL） 中，37℃ 180 r/min振荡培养16～18 h，提取质粒DNA，经 BamH I 和Sal Ⅰ双酶切鉴定正确后，将阳性克隆质粒命名为pMD18-T-OMP2，并送上海英骏生物技术公司测序。

1.6 副猪嗜血杆菌OMP2 基因编码蛋白的生物信息学分析

利用 DNAMAN、MEGA、DNAStar 软件及互联网上的分析软件，对所克隆的OMP2 基因进行核苷酸序列、编码的氨基酸序列、蛋白分子理化特性征、信号肽、跨膜区、抗原表位及蛋白结构进行预测分析。

2 结果

2.1 OMP2 基因扩增结果

PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带约为1092 bp（图1），与预期片段大小相符。

图1 OMP2 基因的PCR 扩增结果

2.2 重组质粒双酶切鉴定结果

将回收纯化的后的PCR 产物与pMD18-T 载体连接，筛选的阳性重组克隆质粒pMD18-T-OMP2 经BamHI和SalⅠ双酶切鉴定后可见与预期大小相符的条带（图2）。

图2 重组质粒pMD18-T-OMP2 双酶切鉴定结果

2.3 副猪嗜血杆菌OMP2 基因的核苷酸序列分析

经序列测定分析表明，扩增出的基因片段全长为1092 bp，编码363个氨基酸，与GenBank 所登录的副猪嗜血杆菌SH0165 株基因组(登录号：NC_011852)对应的OMP2 基因核苷酸序列同源性99.8%，其中本实验测序的副猪嗜血杆菌OMP2 基因在175 位和177 位发生了碱基突变，分别由T →C和A →G，但编码的氨基酸序列并未发生变化，同源性为100%。

2.4 副猪嗜血杆菌OMP2 外膜蛋白分子特征

应 用DNAMAN 和ExPASy 服务器上的ProtParam 软件（http://web.expasy.org/protparam/） 对副猪嗜血杆菌OMP2 基因编码的外膜蛋白P2 分子特征进行分析，推导出的外膜蛋白P2 原子总数为5463，分子式C1733H2700N482O546S2，分子质量为39087.45 Daltons（道尔顿），含有47个强碱性氨基酸（K、R)、38 个强酸性氨基酸(D、E)、114 个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)、106 个极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)；等电点pI 为9.21；半衰期为30h（体外哺乳类网状细胞）、大于20h（酵母体内）、大于10h（大肠杆菌体内）；不稳定系数为16.73，推测OMP2 外膜蛋白为稳定性蛋白；脂肪指数为70.63，总体平均亲水性为-0.494。

2.5 副猪嗜血杆菌OMP2 外膜蛋白的二级结构预测

应用DNAStar中的Karplus-Schulz 方法预测OMP2 外膜蛋白的柔性 区 域，Garnier-Robson 和Chou-Fasman 方法预测OMP2 外膜蛋白的α-螺旋、β-折叠、β 转角和无规则卷曲（图3）。结果可见OMP2 外膜蛋白的柔性区域位于24～35，41～65，4～76，83～97，99～105，120～121，127～132，135，141～146，149～156，161～166，173～177，188～204，216～221，230～240，243～248，266～268，273～281，286～287，293～298，305～311，329，336～352区段，呈现出散在分布。

2.6 副猪嗜血杆菌OMP2 外膜蛋白的抗原表位预测

应 用DNAStar 中 的Kyte-Doolittle 方法预测OMP2 外膜蛋白的亲水区，Jameson-wolf 方法预测OMP2外膜蛋白的抗原指数，Emini 原则预测OMP2 外膜蛋白可能的抗原表位，综合以上各种预测方法表明OMP2 外膜蛋白可能的抗原表位区为N 端第23～35 位、42～63 位、73～105 位、147～157位、229～249 位、186～201 位、304～313 位、340～351 位（图4）。

图 3 根据2 种不同的方法预测副猪嗜血杆菌OMP2 外膜蛋白的二级结构

图4 OMP2 外膜蛋白亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测结果

2.7 副猪嗜血杆菌OMP2 的信号肽和跨膜区预测

利用SignalP 软件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 对HPS OMP2 基因编码的蛋白序列进行信号肽预测，利用神经网络(NN)和隐马尔可夫模型(HMM)两种方法进行预测。结果显示，副猪嗜血杆菌OMP2 外膜蛋白序列最前端的19个N-末端氨基酸残基为信号肽序列，最佳切割位点在19～20 个氨基酸，机率为0.933，且信号肽区域主要为疏水性氨基酸（图5 和图6）；而生 物 学 软 件TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测结果表明，OMP2 外膜蛋白无跨膜区。

图5 神经网络法(NN)预测OMP2 外膜蛋白信号肽（Signal P）结果

图6 隐马尔可夫模型(HMM)预测OMP2外膜蛋白信号肽（Signal P）结果

2.8 副猪嗜血杆菌OMP2 外膜蛋白结构预测

通过PredictProtein 软件（https://www.predictprotein.org/） 预 测，OMP2 外膜蛋白可能含有4 个N-糖基化位点、1 个cAMP 和cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点、8 个蛋白激酶C 磷酸化位点、7 个酪蛋白激酶II 磷酸化位点、1 个酪氨酸激酶磷酸化位点、9 个N-肉豆蔻酰化位点。

3 讨论

副猪嗜血杆菌是猪呼吸道的一种常在菌，在猪群受到应激或者感染其他疾病的情况下容易导致该病的流行。随着规模化养猪业的不断发展，HPS 与其他细菌或病毒混合感染的趋势也日益严重，所以建立一种特异和快速的用于检测HPS 的诊断方法以及研制预防HPS 新型高效安全的疫苗具有重要的意义。本研究运用PCR 技术成功地扩增了HPS 的OMP2 基因，序列测定表明该基因全长1092bp，编码363 个氨基酸，与GenBank 所登录的副猪嗜血杆菌SH0165 株对应核苷酸序列同源性为99.8%，氨基酸序列同源性为100%；该蛋白不稳定系数为16.73，推测其为稳定性蛋白；对OMP2 基因编码的OMP2外膜蛋白二级结构预测分析，结果显示OMP2 基因含有α-螺旋、β-折叠、β 转角和无规则卷曲，柔性区域呈散在分布，而且具有较多的亲水性区域，是一种亲水性蛋白；信号肽预测结果显示，OMP2 外膜蛋白序列最前端的19 个N-末端氨基酸残基为信号肽序列，最佳切割位点在19～20 个氨基酸，机率为0.933，且信号肽区域主要为疏水性氨基酸，由于疏水区的存在不利于蛋白的表达，所以去掉信号肽序列有利于外膜蛋白的表达；跨膜区预测结果表明，OMP2 外膜蛋白无跨膜区，提示该蛋白可能实现较高量及可溶性的表达；对OMP2 外膜蛋白结构预测显示，该蛋白可能含有4 个N-糖基化位点、1 个cAMP 和cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点、8 个蛋白激酶C 磷酸化位点、7个酪蛋白激酶II 磷酸化位点、1 个酪氨酸激酶磷酸化位点、9 个N-肉豆蔻酰化位点。以上分析结果表明，OMP2 基因编码的OMP2 外膜蛋白是一种具有前导信号肽的分泌型蛋白，而且推测出的多个修饰性位点可能对其前体蛋白的加工或生物功能具有重要的调节作用。

近年来的研究表明，革兰氏阴性细菌的外膜蛋白在细菌的致病过程中起着十分重要的作用。由HPS 的OMP2 基因编码的OMP2 外膜蛋白，是HPS 一种重要的毒力因子，也是一种具有免疫显性的膜孔蛋白，作为一种膜孔蛋白，OMP2 外膜蛋白在由烟酰胺衍生的核苷酸底物的一般扩散和特定运输均起到一定的功能，而且对不同血清型的副猪嗜血杆菌株都具有相当程度的抗原异质性，所以可以预测如果用OMP2 基因的表达产物建立的ELISA 诊断方法应该可以检测HPS 所有的血清型，李淼等[8]建立了基于重组HPS OMP2 外膜蛋白的检测检测HPS 抗体的间接ELISA方法，结果该方法对于国内外广泛流行的 4，5，12，13 四种血清型HPS 均具有交叉反应，而对其他几种常见的猪病毒和细菌病原均为阴性反应，表明该方法具有良好地特异性。在副猪嗜血杆菌病的诊断中，目前虽然已有用全菌裂解抗原或荚膜多糖抗原建立的ELISA 检测方法的报道，但其特异性不强[9-10]。此外，对流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）OMP2 外膜蛋白的研究表明，OMP2 外膜蛋白在HPS 定植以及与人黏蛋白特定组分结合的过程中可能发挥一定的作用，而且OMP2 外膜蛋白在通过烟酰胺衍生的核苷酸底物定植在人的呼吸道上是相对稳定的。因此，OMP2 外膜蛋白被认为是一种潜在的疫苗候选株。本实验通过对副猪嗜血杆菌OMP2 基因的扩增、克隆以及生物信息学分析，为进一步深入研究OMP2 基因提供了理论基础。

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