不同剂量的DEHP对子代大鼠学习记忆的影响

张晶莹 宋昕恬 孟令仪

DEHP(邻苯二甲酸二乙基己酯)属于邻苯二甲酯类化合物，是目前塑料工业中应用最广泛的增塑剂之一，主要应用于各种塑料产品如纤维素树脂、聚乙烯和聚氯乙烯食品包装材料和医用材料的生产加工。目前，邻苯二甲酸酯在自然环境中分布的范围非常广，几乎无处不在。调查发现，有13种物质在所有受测试者身上都被发现，含量最高的首推DEHP［1］，这种物质可能导致内分泌失调，影响生殖、妊娠和性功能。DEHP可以通过胎盘屏障进入胎儿体内聚集，也可直接作用于胎儿［2，3］。如果在孕期接触DEHP，由于胎儿的血脑屏障尚未发育完成，DEHP可能通过胎盘进入胎儿的中枢神经系统，从而影响到子代的脑发育，造成神经毒性的损害［4］。DEHP可能会引起神经毒性，但国内外有关DEHP的神经毒性及其机制的系统报道较少，本研究拟通过DEHP的胚胎期暴露研究DEHP对于子代大鼠神经发育，初步探讨不同剂量的DEHP对子代大鼠学习记忆的影响，为今后对DEHP的深入研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DEHP(分析纯)，美国Sigma公司。玉米油，市售。

1.2 实验动物分组与染毒 Wistar大鼠35只，其中雌性25只，雄性50只，体重200～250 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，生产许可证号:SCXK-(吉)2011-0004。动物自由饮水摄食，饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号:SCXK-(吉)2010～0001。动物室温度20～22℃，相对湿度55% ～65%，适应性饲养7 d，按体重随机分为4组:对照组和低、中、高剂量组，每组6只。动物交配雌雄大鼠以1∶1同笼，次日晨于盘底及阴道检查阴栓，查出阴栓者，记为妊娠0 d，母鼠编号称重，在妊娠期7～16 d，高、中、低三剂量组每天经口灌胃给予DEHP，给予DEHP的量均为1.0 ml/100 g BW，对照组经口灌胃给予等量玉米油。同时进行如下处理。对照组:给予母鼠对照物玉米油;高剂量组:染毒母鼠DEHP 1000 mg/kg;中剂量组:染毒母鼠DEHP 750 mg/kg;低剂量组:染毒母鼠DEHP 250 mg/kg。孕鼠产子后，单独一笼哺养幼鼠。实验时，每笼选取雌雄两只子代大鼠进行神经行为学测定。

1.3 仔鼠行为学改变的测定

1.3.1 跳台实验 实验时，将离乳的子代大鼠置于箱中，自由活动5 min，然后将其置于安全台上，箱底通电，观察其跳台的潜伏期(latency，L)并记录5 min内仔鼠跳下台的次数，即错误次数(mistake，M)，此为训练成绩，24 h后再测为测试成绩。

1.3.2 避暗实验 实验时将离乳的子代大鼠头部背对着洞口放入明室，仔鼠一进入暗室立即受电击，记录仔鼠5 min内进入暗室的错误次数，此为训练成绩，24 h后再测为测试成绩。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 10.5统计软件进行单因素方差分析。组间比较采用最小显著差异法检验(LSD法)。

2 结果

2.1 DEHP对子代大鼠跳台实验的测定 如表1所示，跳台实验中高、中、低剂量组与对照组比较，错误次数明显增多，平均潜伏期明显缩短(P＜0.05)，学习记忆能力明显减退;高剂量组与中、低剂量组比较，子代大鼠错误次数明显增多，潜伏期明显缩短(P＜0.05)。

2.2 DEHP对子代大鼠避暗实验的测定 如表2所示，高、中、低剂量组子代大鼠进入暗箱的潜伏期缩短明显低于对照组(P＜0.05)及子代大鼠5 min内受电击次数明显高于对照组(P＜0.05)，说明高、中、低剂量组子代大鼠的记忆能力明显降低;高剂量组子代大鼠进入暗箱的潜伏期缩短与中、低剂量组比较有显著性(P＜0.05);高剂量组子代大鼠进入暗室的错误次数增多与低剂量组比较有显著性(P＜0.05)。

表1 DEHP对子代大鼠跳台测试结果的影响(±s)

表1 DEHP对子代大鼠跳台测试结果的影响(±s)

注:a与正常对照组比较，P＜0.05;b与高剂量组比较，P＜0.05

组别 例数 跳台法潜伏期(s)错误次数正常对照组12 95.47±9.16 3.00±1.21高剂量组 12 58.48±9.25a 7.75±1.22a中剂量组 12 78.60±11.98ab 7.00±1.21a低剂量组 12 85.91±10.69ab 5.73±1.19ab

表2 DEHP对子代大鼠避暗测试结果的影响

3 讨论

DEHP可经胃肠道、肺和皮肤吸收，通常以胃肠道为主要吸收途径。进入胃肠道后，DEHP受胰腺酶和肠道内一些酶的作用，大部分迅速由双酯转化为单酯(MEHP)，然后被吸收。DEHP及其代谢产物主要分布于血液、肝脏、肾脏、胃肠道以及脂肪组织，其中在大鼠的睾丸组织中浓度相对较高。DEHP进入体内代谢的第一步就是水解成为单酯系列，主要在胃肠道进行［5］。DEHP进入体内后被迅速降解，美国环境保护署报道，DEHP在人体内的半衰期平均为12 h。Andral AJ［6］研究认为DEHP孕期染毒可导致子代大鼠下丘脑视前交叉区芳香化酶表达降低，活性下降。有研究表明［7］随着DEHP浓度增高，小鼠脑组织细胞DNA的损伤随之加重，DEHP的浓度达到125 mg/kg和375 m/kg时，其可造成DNA的显著断裂(P＜0.01)。另研究表明，雌性大鼠妊娠期经口灌胃DEHP染毒，可造成孕鼠着床数降低;胚胎数、活胎数减少。可见DEHP能够通过胎盘屏障进入胚胎体内，影响胚胎发育，具有致畸性［8］。

DEHP可以通过胎盘屏障进入胎儿体内，在胎儿体内聚集，动物实验表明其具有致畸性，可直接作用于胎儿，也可通过干扰胎盘屏障影响胎儿发育［2，3］。导致胚胎发育异常的机制目前尚不明确，已经报道以下相关机制:①DEHP可以与过氧化物酶增殖体激活体(PPAR)作用，激活PPAR的亚型，影响胎盘滋养层细胞脂类物质的代谢。②在器官形成的关键时期，DEHP通过影响与锌代谢有关的基因:金属硫蛋白-1(MT-1)、金属硫蛋白-2(MT-2)、锌运转体蛋白(ZnT-1)等的表达导致畸形。③可影响某些基因的表达，进而影响胚胎发育。Hokanson等［9］在体外培养人类MCF-7细胞株，探讨DEHP对基因表达的影响，结果表明DEHP可以改变许多基因的表达，其中包括FGD1和PAFAH1B1，这两个基因对胚胎大脑发育非常重要，DEHP使这两个基因表达下调，推测DEHP可能会影响神经系统发育并使认知功能发生障碍。本研究通过神经行为学实验方法结果显示，跳台实验中高、中、低剂量组与对照组比较，错误次数明显增多，平均潜伏期明显缩短(P＜0.05);高剂量组与中、低剂量组比较，子代大鼠错误次数明显增多，潜伏期明显缩短(P＜0.05)。避暗实验中高、中、低剂量组子代大鼠进入暗箱的潜伏期缩短明显低于对照组(P＜0.05)及子代大鼠5 min内受电击次数明显高于对照组(P＜0.05);高剂量组子代大鼠进入暗箱的潜伏期缩短与中、低剂量组比较有统计学意义(P＜0.05);高剂量组子代大鼠进入暗室的错误次数增多与低剂量组比较有统计学意义(P＜0.05)。说明DEHP对子代大鼠中枢神经系统损害有一定的影响，子代大鼠学习记忆能力明显减退。目前，对DEHP的神经毒性机制尚无明确的结论，由于本次试验的局限性，仍有待进行更加深入的研究探讨。

［1］Gunnarsson D，Leffler P，Ekwurtzel E，et al.Mono-(2-ethylhexyl)phthalate stimulates basal steroidogenesis by a cAMP-independent mechanism in mouse gonadal cells of both sexes.Reproduction，2008，135:693-703.

［2］Xu Y，AgrawalS，Cook TJ，et al.Di-(2-ethylhexyl)-phthalate affects lipid profiling in fet al rat brain upon matenal exposure.Arch Toxicol，2007，1(1):57-62.

［3］Xu Y，Kanipp GT，Cook TJ.Effects of di-(2-ethylhexyl)-phthalate and its metabolites on the lipid profiling in rat HRP-1 trophoblast cells.Arch Toxicol，2006，80(5):293-298.

［4］Hokanson R，Hanneman W.DEHP，bis(2)-ethylhexyl phthalate，alters gene expression in human cells:possible correlation with initiation of fet al developmental abnormalities.Hum Exp Toxicol，2006，25(12):687-695.

［5］于淑江，安丽红，李杰.邻苯二甲陵二(2一乙基己基)酯毒性作用.中国公共卫生，2005，22(5):589.

［6］Andrade AJ，Grande SW.A dose-response study following in utero and lactational exposure to di-(2-ethylhexyl)Phthalate(DEHP):non-monotonic dose-response and low dose effects on rat brain aromatase activity.Toxicology，2006，227(3):185-192.

［7］潘亮，逯晓波.邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯胚胎期暴露对子代大鼠发育的影响.辽宁医学杂志，2010，24(1):8-12.

［8］王心.邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯的雌性生殖毒性研究.西安:第四军医大学，2009.

［9］Hokanson R，Hanneman W，Hennossey M，et al.DEHP，bis(2)-ethylhexyl phtbelate alters gene expression in human cells possible correlation with in itiatlon of fet al developmental abnomalifies.Hum Exp Toxieol，2006，25(12):687.