降钙素基因相关肽对脑死亡大鼠肺组织氧化应激的影响

苗丽君 张瑞霞 王 静 蒋军广 韩雪萍 张水军 孙振涛

(郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州450052)

降钙素基因相关肽对脑死亡大鼠肺组织氧化应激的影响

苗丽君 张瑞霞 王 静 蒋军广 韩雪萍1张水军2孙振涛1

(郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州450052)

目的 观察脑死亡大鼠肺组织的氧化应激反应以及降钙素基因相关肽(CGRP)干预处理对脑死亡大鼠肺组织氧化应激的影响。方法 健康Wistar大鼠15只，随机分为3组，即对照组(A组)、脑死亡组(B组)及CGRP处理组(C组)，每组5只。A组持续麻醉维持12 h。B组通过呼吸、循环支持维持大鼠脑死亡状态12 h。C组于脑死亡模型建立成功后静脉输注CGRP 3 μg/kg，随后给予CGRP 6 μg/kg持续输注维持12 h，维持实验动物脑死亡状态12 h。于脑死亡后12 h取肺脏组织，检测MDA含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性及肺组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA和蛋白表达水平。结果 肺组织中MDA含量B组高于A组及C组(P＜0.05)，肺组织SOD活性C组高于B组及A组(P＜0.05)，肺组织γ-GCS mRNA水平C组＞B组＞A组，γ-GCS蛋白水平C组＞A组＞B组，组间比较差异均有统计学意义(均P＜0.05)。结论 脑死亡可导致大鼠肺组织氧化应激反应增强，抗氧化能力减弱;CGRP可增高脑死亡大鼠肺组织γ-GCS蛋白水平，增高抗氧化能力，抑制氧化应激反应。

脑死亡;肺;氧化应激;降钙素基因相关肽

脑死亡供体的器官保护已经成为器官移植技术的关键环节之一，有效的器官保护不仅可以提高移植后器官的成活率，也能加快器官功能的恢复，脑死亡供体器官损伤的机制及防护已经成为目前的研究热点。研究证实氧化应激在肺损伤的发生发展中具有重要作用〔1～3〕。降钙素基因相关肽(CGRP)有血管舒张作用，心肌正性变力、变时作用，缺血再灌注损伤保护作用等多种生物学功能〔4〕。本实验拟在建立大鼠脑死亡模型基础上，检测肺组织中氧化应激(OS)水平的改变，以及CGRP干预处理对脑死亡大鼠肺组织OS的影响，为脑死亡后的肺保护提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

健康Wistar大鼠15只，雌雄不限，体重250～300 g，SPF级，由河南省实验动物中心提供。术前12 h禁食，自由饮水。肌内注射阿托品0.03 mg/kg，10%的水合氯醛腹腔注射进行麻醉。麻醉后，行股动静脉插管、气管内插管，开颅后颅内放置Foley气囊导管。随机分为3组：对照组(A组)、脑死亡组(B组)与CGRP组(C组)，每组5只。A组持续麻醉维持12 h，不建立脑死亡模型，12 h后撤除麻醉，动物苏醒后处死。B组大鼠参照文献〔5～7〕，在球囊导管内逐渐缓慢注入生理盐水行颅内加压，加压速度约为0.1 ml/min，直至达到脑死亡状态;大鼠呼吸停止后，将气管导管接Harvard Inspira ASV动物呼吸机，机控呼吸，设定呼吸机参数为：潮气量为8.0 ml/kg，呼吸频率为60次/min;维持平均动脉压在正常范围(60 mmHg以上)，必要时根据情况使用多巴胺及血管加压素等血管活性药物;脑死亡判定标准为：瞳孔散大固定，无角膜反射、对刺激无反应、脑干反射消失、呼吸停止、静息脑电图〔8〕;通过呼吸、循环支持维持实验动物脑死亡状态12 h;12 h后撤除呼吸、循环支持，动物心肺死亡。C组为CGRP干预的脑死亡组，同样采用缓慢颅内加压法建立大鼠脑死亡模型;于脑死亡模型建立成功后经静脉用微量输注泵给予 CGRP 3 μg/kg(30 min内输注完毕)，随后给予CGRP 6 μg/kg持续输注维持12 h〔9〕，CGRP 购自 Sigma 公司。

1.2 标本采集及检测方法

在脑死亡12 h时点留取肺组织，硫代巴比妥钠法测定肺匀浆中丙二醛(MDA)含量，黄嘌呤氧化酶法测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，MDA、SOD检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。采用RT-PCR方法检测肺组织中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA水平。γ-GCS引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成：上游引物为：5'-TAA TCT TGC CTC CTG CTG T-3';下游引物为：5'-CTT CCT GGA AAC TTG CCT C-3';扩增片段长度约为122 bp。退火温度52℃。内参GAPDH引物：上游引物为：5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC-3';下游引物为：5'-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3';扩增片段长度约为568 bp。退火温度58℃。产物置于20 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶图像分析仪下测目的基因及内参照吸光度值并摄像，将内参引物GAPDH的吸光度值设定为标准数1，γ-GCS与其所对应的GAPDH比为标准值(相对表达量)即为最后的γ-GCS基因相对含量。采用免疫印迹方法测肺组织γ-GCS蛋白表达，暗室曝光显色后拍照，然后扫描至计算机，使用图像分析系统计算待测条带的吸光度×面积，与其内参照的吸光度×面积的比值作为其蛋白质表达水平的相对指标。γ-GCS抗体购自圣克鲁斯生物技术公司。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 肺组织MDA含量及SOD活性

组高于A组及C组，C组高于A组(均P＜0.05)，肺组织SOD活性B组低于A组及C组(均P＜0.05)。见表1。

2.2 大鼠肺组织 γ-GCS mRNA及蛋白表达比较

肺组织γ-GCS mRNA水平B组、C组均较A组升高，C组较B组升高(均P＜0.05)。肺组织γ-GCS蛋白水平B组较A组降低，C组较B组、A组增高，组间比较差异均有统计学意义(均P＜0.05)。见表 1、图 1、图 2。

肺组织中MDA含量B

表1 各组动物肺组织中MDA含量、SOD活性、γ-GCS mRNA及蛋白表达水平比较(n=5s)

表1 各组动物肺组织中MDA含量、SOD活性、γ-GCS mRNA及蛋白表达水平比较(n=5s)

与A组比较：1)P＜0.05;与B组比较：2)P＜0.05

组别MDA(μmol/g prot)SOD(kU/g prot) γ-GCS mRNA γ-GCS 蛋白A组 1.12±0.41 129.48±11.792)0.17±0.01 0.05±0.01 B组 3.78±0.471) 103.27±13.82 0.19±0.011) 0.03±0.011)C组2.68±0.511)2)137.58±12.652)0.32±0.041)2)0.11±0.031)2)

图1 各组γ-GCS mRNA水平

图2 各组γ-GCS蛋白表达水平

3 讨论

脑死亡后肺组织中MDA含量升高及SOD活性水平下降，说明脑死亡后OS反应增强，抗氧化能力减弱。OS本质是机体的一种基本的自我保护机制，参与体内炎症、免疫、增殖、细胞再生、修复等多种重要生命过程的调节。OS多发生在机体遭受各种有害刺激时，正常生理条件下，体内氧化和抗氧化系统保持动态平衡，机体的抗氧化系统，如SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等，可以及时快速清除体内过剩的ROS。如果氧化应激反应失控，抗氧化酶表达不足，体内氧化与抗氧化作用失衡，抗氧化作用不足而氧化作用过强，就极可能导致细胞凋亡和组织发生不同程度损伤〔10～12〕。脑死亡作为一种严重的伤害性刺激，启动了机体的氧化应激系统，导致脑死亡大鼠肺组织氧化和抗氧化平衡发生了改变。

本实验结果显示脑死亡大鼠γ-GCS mRNA水平升高但γ-GCS蛋白水平下降，说明脑死亡应激后的γ-GCS mRNA水平较对照组有一定程度代偿性升高，mRNA和蛋白水平是一个相偶联的过程，但是两者没有必然一致的趋势，细胞核相应 mRNA的合成速度，细胞质相应mRNA的降解速度对蛋白的浓度都会产生影响，可能因为抗氧化蛋白酶γ-GCS耗竭大于生成，所以γ-GCS蛋白水平下降。γ-GCS是核因子E2相关因子2(Nrf2)驱动的靶基因〔13〕，是受Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)信号通路转录调节的抗氧化蛋白之一〔14〕，而Nrf2具有多器官保护作用〔15〕，如Nrf2可通过增加解毒和抗氧化能力保护肺脏抵御二丁基羟基甲苯诱导的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、高氧损伤和博来霉素介导的肺纤维化〔16〕。谷胱甘肽(GSH)是细胞内最重要的抗氧化剂，对纠正氧化失衡，保护肺组织免受氧化损伤起关键作用;对保持气道上皮细胞完整性，抵御肺部损伤与炎症等方面非常重要〔17〕。内源性谷胱甘肽主要存在于胞浆内，γ-GCS是其合成的关键限速酶，调控GSH生成的速度和量〔18〕。γ-GCS蛋白表达降低，谷胱甘肽合成减少，就会导致局部肺组织氧化/抗氧化系统失衡〔19〕。γ-GCS表达上调，抗氧化作用增强则对肺组织损伤有保护作用〔20〕。

CGRP是一种由辣椒素敏感的感觉神经末梢释放的神经递质，在体内有广泛的分布和表达，有内皮细胞保护作用、肺损伤保护作用等多种生理功能。CGRP作为神经元钙调蛋白依赖激酶cAMP反应元件结合蛋白的调节因子，可以调节p38 MAPKNF-κB级联反应。另外，CGRP可能通过抑制p38 MAPK磷酸化抑制H2O2诱导的Nox4表达，进而降低强活性氧的产生发挥保护内皮的作用〔10〕。Schaeffer等〔11〕的研究还表明：CGRP 是通过调节MAPK，ERK1/2和P38的蛋白激酶的激活拮抗氧化应激诱导细胞凋亡。本实验显示脑死亡大鼠γ-GCS蛋白表达水平下降，机体抗氧化保护功能下降，促进了脑死亡后肺损伤的发展，采用CGRP干预治疗后脑死亡大鼠体内抗氧化物酶γ-GCS水平上升、SOD活力显著升高，表明CGRP可能通过升高γ-GCS水平促进机体抗氧化功能的升高而起到肺保护作用。

综上所述，脑死亡可导致大鼠肺组织氧化应激反应增强，CGRP可通过升高γ-GCS水平抑制脑死亡大鼠氧化应激反应。

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R56

A

1005-9202(2012)23-5186-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.039

河南省卫生科技创新人才工程项目(4088);河南省医学科技重大攻关项目(200902019)

1 本院麻醉科 2 本院外科

蒋军广(1963-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事呼吸疾病的基础及临床研究。

苗丽君(1970-)，女，副教授，副主任医师，硕士生导师，在读博士，主要从事呼吸疾病的基础及临床研究。

〔2012-06-25收稿 2012-10-10修回〕

(编辑 曲 莉)