正交法优选夜宁胶囊中灵芝镇静成分提取工艺的研究

周晓东 李莹 丁青龙

正交法优选夜宁胶囊中灵芝镇静成分提取工艺的研究

周晓东 李莹 丁青龙

目的 用正交试验研究中药灵芝中镇静成分的提取工艺。方法 采用四因素三水平的正交实验设计，以出膏率和灵芝多糖及总糖含量为指标，用紫外分光光度计测定浸膏中灵芝多糖及总糖含量，筛选最佳工艺条件。结果 40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸腾状态2 h为最佳工艺。结论 以正交试验法优选的灵芝镇静成分提取工艺方法简单，结果稳定，效果满意，从而确保质量。

灵芝;灵芝多糖;总糖;提取工艺;正交试验

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥实体。在中医临床应用已有悠久的历史，自古认为有益气血，安心神，健脾胃之功效。主治虚劳，心悸，失眠，头晕，神疲乏力，久咳气喘等。古代很多文献对其都有记载：《新修本草》：“芝安心神”，《本草纲目》：“紫芝疗虚痨”;《中国药用植物图鉴》：“治神经衰弱、失眠、消化不良等慢性疾病。”;《中国中草药汇编》：“滋养强壮。主治头晕，失眠，神经衰弱，高血压病，血胆固醇过高症，肝炎，慢性支气管炎，哮喘等病。”;《中国传统补品补药》：“养心安神，补肺益肝。适用于血不养心，心悸失眠健忘，肺虚咳喘，久咳不好，以及肝炎恢复期，神疲纳呆等症。”。

现代药理研究证明其醇水提取液可明显增强戊巴比妥钠的中抑制作用(翻正反射消失)，并有抗电惊厥作用［1］。本文采用分光光度法测定了灵芝醇水提取物中总糖及灵芝多糖的含量，方法简便快速，灵敏度高，重现性好，可作为灵芝提取物的质量及工艺的控制方法。

1 材料与方法

1.1 一般材料

原料：干燥实体多孔菌科真菌赤芝。试剂：乙醇，苯酚，硫酸等试剂均为分析醇，水为重蒸馏水，碱性酒石碳酸铜溶液试药：99.99%葡萄糖。

1.2 仪器

752型紫外分光光度计(上海分析仪器厂);FQC-100超声波清洗机(无锡福尼达电子公司，40KHz)80-2型台式离心机(上海分析器械厂);电子分析天平，RE-52C型旋转蒸发仪(上海青铺沪西仪器厂)，SC202-1型电热恒温干燥箱(通州市沪通制药机械设备厂)，FA1004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，植物粉碎机(中国天津泰新特仪器有限责任公司)

1.3 方法

1.3.1 提取方法 分别采用回流提取法、超声提取法、浸渍提取法，应用L9(34)正交表实施实验

1.4 灵芝在不同提取工艺和不同浓度的乙醇溶液中的总糖和灵芝醇溶性多糖的含量测定。

1.4.1 对照品溶液的制备 精密称取在105℃干燥至恒重的无水葡萄糖9.8 mg置100 ml容量瓶中加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.4.2 样品溶液的制备 精密称取各组正交试验105℃干燥至恒重的灵芝浸膏等量于离心管中中加水至10 ml，超声30 min溶解，定容至10 ml，得总糖供试液(1)。将总糖供试液用85%乙醇处理至无单糖存在(用碱性酒石酸铜检查)得多糖供试液(2)［2］。

1.4.3 测定波长的选择 分别取标准储备液2.0 ml，样品液0.2 ml，阴性对照液0.2 ml，以同量蒸馏水为空白，按标准曲线项下操作后，在UD光度计上对400～600 nm波长区间进行扫描，得最大吸收波长λmax为490 nm，并且在此波长处阴性对照液的吸光度值在0.005以下，不影响测定，故选用490 nm 为测定波长［3］。

1.4.4 标准曲线的制备 分别精密吸收0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml标准液于10 ml容量瓶中加蒸馏水至1.0 ml分别加新配制的5%苯酚1.5 ml再加98%H2SO47.5 ml，充分摇匀置室温下反应20 min至恒温后在490 nm处测吸收度［4］，并进行回归处理：A=665.8163C-0.0357，相关系数r=0.9995。

1.4.5 供试品溶液的测定 分别精密量取样品溶液(1)、(2)0.2 ml，按标准曲线项下操作，测得吸收度，根据回归方程计算含量。

1.5 提取工艺

1.5.1 原药材的处理 取灵芝原药材，粉碎，过目筛分样，置65℃烘箱中烘2 h，置干燥器中冷却至室温，备用。

1.5.2 回流提取法

1.5.2.1 工艺流程 称取不同目数药材5 g→回流提取→抽滤→回收乙醇→测定浸膏量、灵芝多糖和总糖含量。

1.5.2.2 因素-水平表

3.2.3 正交表 L9(34) 加权评分公式为：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.2198

表1

表2

加权评分结果确定：A1B3C2D3其中RA＞RB＞RC＞RD

即回流最佳提取工艺为：40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸腾状态2 h。

3.3 超声提取法

3.3.1 工艺流程 称取药材粉末→超声提取→抽滤→回收溶剂→测定总糖、多糖含量、测定浸膏量。

3.3.2 因素-水平表

表3

3.3.3 正交表 L9(34) 加权评分公式为：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.8037

表4

加权评分结果确定：A1B3C1D3其中RD＞RA＞RB＞RC

即超声最佳工艺为：＞40目药材粉末加相当于药材30倍量的70%乙醇超声20 min。

3.4 浸渍提取法

3.4.1 工艺流程 称取不同目数药材粉末1 g→浸渍不同天数→回收溶剂→测定总糖、多糖含量、测定浸膏量

3.4.2 因素-水平表

表4

3.4.3 正交表 L9(34) 加权评分公式为：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.4647

表5

加权评分结果确定：A1B3C2D3其中RA＞RD＞RC＞RB

确定最佳工艺为：40倍量的70%乙醇，大于40目的灵芝粉浸渍8 d。

3.5 最佳工艺的确定

选择回流提取法、浸渍提取法和超声提取法中的最佳工艺条件，每组重复五次，结果如表所示。其中加权评分公式为：

表6

两两比较三个总体均数的差异

表7

4 结果处理

先将回流组和超声组作比较：ta=(X1－X2)/(Sw√n1-1+n2-1)=23.9788对 α =0.05，f=5+5-2=8，查表得 t0.05/2(8)=2.306故|t|＞tα/2即P＜0.05，故回流组和超声组其差异有显著性意义，且回流组高于超声组。

再将含量较高的回流组和浸渍组作比较：ta=6.2820，即|t|＞tα/2，P＜0.05，故回流组和浸渍组的差异也有显著性意义，且回流组高于浸渍组。经过两两正态总体均数的差异的比较可知：回流组评分分别高于另外超声，浸渍两组。因此得出：40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸腾状态2 h为最佳工艺。

5 讨论

本实验利用正交表，对多因素、多水平且各因素间存在相互作用而具有随机误差的试验，通过少数代表性强的试验，利用统计分析方法，较快地找出合理的试验方案，省时省力，方法可取。

由于正交试验时无空白对照组且无重复试验，故只采用了直观方差分析法。在三种方法的最佳工艺确定时，采用了以少量样本比较正态总体均数差异的方法，可信度较高。

现代药理研究表明灵芝的醇提液对实验动物的中枢神经有明显的抑制作用，有协同本巴比妥的对中枢神经的以致作用，因目前对灵芝的质量还没有可靠的标准。考虑到灵芝中有部分醇溶性的糖，而目前对灵芝研究较多的也就是其中的糖类物质，故以其中的醇溶性的糖作在提取过程中的一个考察指标。

［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·上册(精选本).上海：上海科学技术出版社，1996，172.

［2］仇萍，袁涛，王美丽.灵芝口服液中灵芝多糖含量测定方法研究.湖南中医药导报，2000，6(3)：37.

［3］单卫华，张玲，时延增，梁瑞雪，尚立霞，胡庆文.灵芝菌酵液制剂中灵芝多糖及总糖含量测定.时珍国医国药，2000，11(9)：797.

［4］张春华，周永治，刘延福，等.数理统计方法.山东大学出版社，1994：151-181，250.

211131 南京军区总医院汤山分院药械科(周晓东);南京中医药大学(李莹 丁青龙)

1.3.2 浸膏得率的测定

1.3.2.1 蒸发皿的预处理 蒸发皿置烘箱中105℃烘1 h，置干燥器中冷却至室温，称重W1，继续烘30 min，置干燥器中冷却至室温，称重W2，当W1与W2差之绝对值≤0.3 mg时，置干燥器中备用。

1.3.2.2 浸膏量的测定 剩余提取液以旋转蒸发器减压回收溶剂至稠膏状，转移至蒸发皿中，水浴蒸干，置烘箱中105℃干燥2 h得干浸膏，称重W，计算W-(W1+W2)/2值。