大鼠低摄钙相关性高草酸尿症模型的建立

田 晶，郭宏骞，孙西钊，孙则禹，鲁德生

南京大学医学院 附属鼓楼医院 1急诊科 2泌尿外科，南京 210008

·论著·

大鼠低摄钙相关性高草酸尿症模型的建立

田 晶1，郭宏骞2，孙西钊2，孙则禹2，鲁德生1

南京大学医学院 附属鼓楼医院1急诊科2泌尿外科，南京 210008

目的建立大鼠低摄钙相关性高草酸尿症模型并进行初步探讨。方法健康雄性 SD 大鼠24只，用随机区组设计法分为低剂量钙组、中等剂量钙组及高剂量钙组，连续喂养3 d，各组大鼠在3 d内分别依次给予剂量递减的饮食钙。测量大鼠每天的24 h尿量、尿草酸浓度、尿肌酐浓度并计算24 h尿草酸总排泄量。其中，尿草酸浓度用高效液相色谱法检测，尿肌酐浓度用自动生化分析仪检测。结果24 h尿草酸总排泄量随时间变化而变化(F=7.893,Plt;0.01)；时间因素与分组因素之间无交互作用(F=1.142,Pgt;0.05)；24 h尿草酸总排泄量随分组变化而变化(F=3.565,Plt;0.05)。3组大鼠第3天的24 h尿草酸总排泄量均显著高于第1天(Plt;0.05)。结论通过控制饮食钙摄入水平，成功建立了大鼠低摄钙相关性高草酸尿症模型。

草酸钙结石；饮食钙；高草酸尿症；高钙尿症

ActaAcadMedSin,2012,34(2):134-137

我国是世界上泌尿系结石的三个主要流行地区之一，人群患病率为2%～5%[1]。草酸钙结石是泌尿系结石的主要类型，约占全部尿石的78%和上尿路结石的90%以上。研究表明，我国是低钙饮食国，钙是我国居民膳食中最缺乏的营养素之一[2]。笔者认为，由于国人长期低钙饮食，引起肠中游离草酸吸收过多，导致尿草酸排泄增多，可导致“低摄钙相关性高草酸尿症”，从而提高尿中草酸钙的过饱和度，最终增加草酸钙结石发生的危险性。本研究试图在大鼠体内建立“低摄钙相关性高草酸尿症”模型并进行初步探讨。

材料和方法

主要试剂与仪器

仪器：大鼠代谢笼由苏州枫桥净化设备公司提供。东芝全自动生化分析仪由我院检验中心提供。Agilent 1100 型高效液相色谱仪,包括四元泵、在线脱气机、可变波长检测器、色谱工作站;台式离心机TGL216G(上海安亭科学仪器厂) ;0122μm 孔径微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂) ;雷磁PHS23C 型精密pH计(上海雷磁仪器厂) ;AG204 精密电子天平(瑞士)。

试剂：基础饲料成分由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供，其中纤维素为微晶纤维素，微量元素、碳酸钙、草酸钠等均为分析纯。高效液相色谱法检测所需草酸、磷酸二氢钾、四丁基硫酸氢铵、磺基水杨酸均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

实验动物及分组健康雄性SD大鼠24只，清洁级，体重173～216 g，由南通大学实验动物中心提供，使用许可证号SCXK(苏)2008-0010。实验室环境密闭、有空调，实验前进行消毒，相对湿度60%，温度(22±2)℃，照明时间为6:30～18:30。采用随机区组设计法，将大鼠分成低剂量钙组、中等剂量钙组和高剂量钙组，每组8只。

饲料配方参照美国官方分析化学师协会[3]制定的大鼠精制饲料配方，属于人工半合成饲料。将配方中的碳酸钙成分去除，制成颗粒状基础饲料，其中，酪蛋白占20%，棉籽油占5%，玉米淀粉占63.81%，混合维生素占0.19%，混合无机盐占5%，纤维素占5%，葡萄糖占1%。此基础饲料不含草酸，未添加碳酸钙，但其中玉米淀粉和棉籽油内仍含微量的天然钙，钙含量总计约0.1255 mg/g饲料，远低于大鼠普通饲料含钙标准，属于低钙无草酸饲料。基础饲料配方制成后，可依实验要求对其中的碳酸钙和草酸钠含量进行增减。本研究3 d内各组大鼠饲料中的Na2C2O4的含量均为0.7482 mg/g，而CaCO3的含量则随时间而递减(表1)。

尿液处理代谢笼分别收集3组大鼠第1～3天内的24 h尿液，装于聚丙烯瓶中。按盐酸∶尿=1∶100加75%浓盐酸，立即用高效液相色谱法测定尿草酸浓度。当日未测完者于4℃冰箱保存。

实验方法实验开始前适应性饲养两周，两周后将大鼠分装于不锈钢代谢笼内，每笼1只，连续喂养3 d(饲养方案同基础饲料配方)。分别测量24只大鼠在第1～3天的24 h尿量、尿草酸浓度、尿肌酐浓度等指标，并计算出用尿肌酐校正的24 h尿草酸总排泄量，此校正结果旨在排除饮水量对尿草酸的影响。校正公式为：24 h尿草酸总排泄量=(尿草酸浓度×24 h尿量)/24 h尿肌酐浓度。其中，尿草酸浓度用高效液相色谱法检测，尿肌酐浓度用自动生化分析仪检测。

统计学处理本研究属于单因素重复测量设计，各组分别进行自身前后对照，同时进行组间对照。定量结果以均数±标准差表示。应用SPSS 17.0中一般线性模型的重复测量模块进行方差分析，并进行不同时间点两两比较。首先对重复测量数据在各时间点之间的关系是否满足Huynh-Feldt条件进行球形检验(χ2=54.711，Plt;0.001)，由于数据不符合Huynh-Feldt条件，表明数据间存在高度的相关性，故采用多变量方差分析。Plt;0.05为差异具有统计学意义。

表 1 3组大鼠第1～3天饲料内CaCO3的含量(mg/g)

结 果

主效应与交互效应分析24 h尿草酸总排泄量随时间变化而变化(F=7.893,Plt;0.01)；时间因素与分组因素之间无交互作用(F=1.142,Pgt;0.05)；24 h尿草酸总排泄量随分组变化而变化(F=3.565,Plt;0.05)。

24h尿草酸总排泄量3组大鼠第3天24 h尿草酸总排泄量均显著高于第1天(Plt;0.05)(表2)。

讨 论

目前国内外对草酸钙结石患者仍然普遍推荐限钙饮食，国内许多泌尿外科学与营养学专著推荐的限钙饮食量甚至低至150 mg/d，还不到国家推荐每日摄钙标准的1/5和欧美国家居民每日钙平均摄入量的1/8。西方学者推荐限钙饮食的理论基础为：欧美国家居民饮食草酸摄入量较少，饮食钙摄入量普遍较高，高钙尿症是其尿石症的主要危险因素。而中国的情况截然相反。据调查，中国人平均日摄钙量仅为405 mg，还不到中国营养学会饮食日推荐量标准(1988年)的一半[4-5]；中国人膳食中植食成分较多，草酸摄入量较高，其膳食结构具有“低钙高草酸”的特点。可见，东西方人的饮食习惯、膳食结构存在明显差异，因而国外推荐的限钙饮食方案未必适用于中国的草酸钙结石患者。本研究拟通过建立大鼠“低摄钙相关性高草酸尿症”模型，围绕饮食钙对尿草酸水平的影响进行初步探讨。

本研究显示，当摄钙量在各自区间内随时间不断递减时，3组大鼠的24 h尿草酸总排泄量均呈递增趋势，提示大鼠饮食钙摄入水平和24 h尿草酸总排泄量密切相关，其尿草酸水平随饮食钙摄入量下降而呈上升趋势。笔者将这种由饮食钙摄入量降低引起的肠源性高草酸尿症暂称之为“低摄钙相关性高草酸尿症”。笔者认为，这种“低摄钙相关性高草酸尿症”的内在机制可能是：正常情况下，饮食钙可与肠内游离草酸形成不溶性草酸钙经粪便排出[6-7]，而当给予低钙饮食时，肠内游离草酸增多，进而增加了饮食草酸的经肠吸收，最终增加了尿草酸的排泄量[8-9]。研究表明，高草酸尿是比高钙尿更危险的成石因素，前者对草酸钙过饱和的影响是后者的10倍[10]。显然，长期低钙饮食可能通过提高尿草酸排泄量，增加发生草酸钙结石的危险性。

实验中的大鼠饲料配方参考美国官方分析化学师协会的饲料配方标准[3]，并模仿中国人膳食结构的“低钙高草酸”特点，各组大鼠的饲料除饮食钙外，其余组分配比(包括饮食草酸)完全相同，以此控制非实验因素产生的误差。实验采用高效液相色谱法测定大鼠尿草酸浓度，草酸最低检测限为0.4 μg/ml[11]，明显提高了检测灵敏度。在实验设计方面采用了自身前后对照和组间对照相结合的方法，提高了实验效率及可靠性。

综上，通过控制大鼠饮食钙摄入量，可以在大鼠体内成功建立“低摄钙相关性高草酸尿症”模型。结合该实验模型与我国居民饮食钙摄入的流行病学资料，笔者认为，我国草酸钙结石患者亦可能存在“低摄钙相关性高草酸尿症”，对此类患者如继续推荐国外的限钙饮食方案，将可能增加草酸钙结石的发病率和复发率，同时将增加低钙相关性疾病(如甲状旁腺功能亢进、骨质疏松症，儿童佝偻病)的危险性。笔者设想，国内草酸钙结石患者不仅不应推荐限钙治疗，反而应提倡符合国家推荐标准的钙饮食，这尚需进一步的临床研究证实。

表 2 3组大鼠24 h尿草酸总排泄量

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EstablishmentofARatModelofLowCalciumDietRelatedHyperoxaluria

TIAN Jing1, GUO Hong-qian2, SUN Xi-zhao2,SUN Ze-yu2, LU De-sheng1

1Emergency Center，2Department of Urinary Surgery，the Affiliated Drum Tower Hospital
of the Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008，China

GUO Hong-qian Tel: 025-83304616-10702, E-mail:gulou-ghq@sina.com

ObjectiveTo establish a rat model of low calcium diet related hyperoxaluria and explore its features.MethodsBy means of randomized blocks design, totally 24 SD male rats were divided into low calcium diet group, medium calcium diet group, and high calcium diet group. Each group was sequentially fed on different calcium diets for 3 days. The urinary volume within 24 hours was recorded, the consistency of urinary oxalate by high-efficiency liquid chromatography, and the consistency of urine creatinine by automatic biochemical analyzer. The consistency was corrected to the output of urinary oxalate of rats in 24 hours, and the results were evaluated by repeated measurement of variance analysis and multivariate analysis of variance.ResultsThe output of urinary oxalate of rats in 24 hours varied with time (F=7.893,Plt;0.01). The time factors showed no association with the group division (F=1.142,Pgt;0.05). The output of urinary oxalate of rats in 24 hours varied with group division (F=3.565,Plt;0.05). The output of urinary oxalate in 24 hours in three groups on the third day was significantly higher than that on the first day (Plt;0.05).ConclusionBy controlling the calcium intake, we successfully established the model of low calcium diet related hyperoxaluria in rat.

calcium oxalate calculus；calcium diet；hyperoxaluria；hypercalciuria

郭宏骞 电话：025-83304616-10702，电子邮件：gulou-ghq@sina.com

R691.4；R696+.5

A

1000-503X(2012)02-0134-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.007

2011-06-27)