三氧化二砷与还原性谷胱甘肽联用诱导HL-60细胞株增殖与凋亡的研究

姜华 王晓华

三氧化二砷与还原性谷胱甘肽联用诱导HL-60细胞株增殖与凋亡的研究

姜华 王晓华

目的 分析研究三氧化二砷与还原型谷胱甘肽联用对人急性髓性白血病HL-60细胞株增殖与凋亡的影响，并初步探讨其诱导HL-60细胞增殖与凋亡的机制。方法 使用CCK8检测细胞存活率，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 在实验条件下，随着浓度增加，三氧化二砷作用下HL-60细胞增殖有所下降，还原型谷胱甘肽作用下HL-60细胞增殖呈现先升高后降低的趋势。同步给药在相同三氧化二砷浓度下，随着还原型谷胱甘肽浓度增加，细胞存活率有所提高，说明还原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷对细胞的增殖抑制作用。由流式检测凋亡率结果提示，还原型谷胱甘肽提前给药增加三氧化二砷对HL-60细胞的促凋亡作用。结论 还原型谷胱甘肽拮抗三氧化二砷对HL-60细胞的增殖抑制作用，而提前给药可增加其对三氧化二砷的促凋亡作用。

细胞凋亡;细胞增殖;三氧化二砷;还原型谷胱甘肽;白血病

三氧化二砷用于治疗急性早幼粒白血病最先在我国获得成功，尤其对于难治、复发的APL效果突出，其主要机理是诱导肿瘤细胞的凋亡，而氧化应激一直被认为是三氧化二砷诱导细胞凋亡的关键原因。还原性谷胱甘肽是广泛存在于细胞内的小分子三肽化合物，由谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸组成，参与细胞内氨基酸转运、糖代谢和DNA合成调节。它既是细胞自由基的清除剂又可作为一种氧化物前体，参与着机体氧化应激过程。本实验旨在探讨三氧化二砷与还原性谷胱甘肽联合用药对HL-60细胞株增殖与凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人白血病细胞(HL-60)由中国医科大学肿瘤研究所提供，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒由碧云天提供，CCK-8试剂盒由日本同仁化学研究所提供，瑞氏-姬姆萨染色试剂盒由南京建成科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代培养 HL-60细胞培养于含有10%胎牛血清的改良1640培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，每2～3天传代1次，实验均选用对数生长期细胞。

1.2.2 CCK-8检测 ①单因素实验组分别继续培养12、24、48、72 h;正交实验组以及不同给药方式对HL-60细胞存活率影响实验组培养时间依据相应的实验样本编号表(表1)。②培养时间点到达后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培养箱中孵育1 h，450 nm下测定吸光度值，进行数据分析。1.2.3 瑞氏-姬姆萨染色 实验组细胞涂片经瑞氏工作液染色1分钟，再加吉姆萨工作液染色20分钟后自然风干，光镜下观察凋亡小体。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 ①800 rpm离心10 min收集细胞，小心吸除上清，加入1 ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，800 rpm离心10 min收集细胞，小心吸除上清，残留约50 μl左右的PBS，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。②加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min。③800 rpm离心10 min收集细胞，小心吸除上清，残留约 50 μl左右的液体，加入190 μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。④加入10 μl Annexin碘化丙啶染色液，轻轻混匀。冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。

表1 实验样本编号分组

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 由直观分析表中极差值可以得出，随着浓度增加，三氧化二砷作用下HL-60细胞增殖有所下降，还原型谷胱甘肽作用下HL-60细胞增殖呈现先升高后降低的趋势。

2.2 由三氧化二砷和还原型谷胱甘肽的交互作用表可以得出，同步给药，在同一三氧化二砷浓度下，随着还原型谷胱甘肽浓度增加，细胞存活率有所提高，说明还原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷对细胞的增殖抑制作用。

2.3 光镜下观察，HL-60细胞经加药处理后出现部分细胞被染深蓝色现象，说明出现细胞凋亡情况;且单独加As2O3组，细胞凋亡明显。

2.4 不同药物作用后HL-60细胞流式检测细胞凋亡的变化，见图1。

图1 流式细胞图

3 讨论

目前治疗白血病的主要手段仍是化疗，但化疗药物在摧毁白血病细胞克隆的同时，也抑制正常骨髓的造血功能，骨髓抑制期发生的贫血、出血、感染、脏器损害等合并症，是化疗后患者死亡的主要原因。化疗药物常常在杀伤肿瘤细胞的同时，不同程度的损伤机体的正常组织和器官，影响化疗进程及药物剂量的选择。在提高白血病的治疗效果并减轻其毒副反应是当前白血病治疗的迫在解决的问题之一。

还原性谷胱甘肽(glutathi-one，GSH)是广泛存在于细胞内的小分子三肽化合物，在拮抗氧化性毒物中发挥重要作用，一方面可与毒物分子及其代谢物发生结合反应降低毒物毒性;另一方面可通过氧化还原反应而降低毒物过氧化的能力，使含巯基酶免于被重金属和氧化剂激活或使已氧化的含巯基酶还原而使其恢复活性。在自由基大量产生时，细胞膜不饱合脂肪酸氧化成脂过氧基，并引起一系列继发损伤。GSH可直接通过供H+拮抗氧自由基毒性，终止连锁反应，其本身则被氧化成谷胱甘肽氧化型(oxidized glutathione，GSSG)。同样，GSH在对抗氧自由基过氧化并抑制由此引发的细胞凋亡、坏死及自稳态改变等方面亦发挥着重要作用［1］。

Chen等［2］认为三价砷是巯基的络合剂，与巯基有很强的亲和力，且它与邻近含巯基或二巯基功能基团的蛋白质的结合能力远高于含单巯基者，因此推测含二巯基基团的蛋白质可能是三氧化二砷作用的主要靶分子。研究证实，砷化物与-SH结合后可能通过多条途径诱导细胞凋亡，比如激活核因子κB使其表达增加，下调凋亡调控基因Bcl-2，上调抑癌基因p53等。此外，砷与-SH结合还直接导致细胞内的GSH耗竭，使活性氧产生增多，而活性氧已被证实是重要的细胞凋亡介质。以上进一步说明，三氧化二砷的凋亡效应与细胞谷胱甘肽氧化还原系统密切相关，三氧化二砷的这一作用与其本身的性质有关。

本组结果显示，表明还原型谷胱甘肽可以拮抗三氧化二砷对细胞的增殖抑制作用。但调整给药时间及顺序，提前应用还原型谷胱甘肽将增加三氧化二砷对HL-60细胞的促凋亡作用。因此，为临床上合理用药，降低化疗副作用保护正常组织的同时而更好的杀伤肿瘤细胞提供理论支持。

［1］赵克然，杨毅军，曹道俊.氧自由基与临床.北京：中国医学科技出版社，2000：47-56.

［2］张晓红，苏立达，吕庆华.三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中IJB-A、NF-JB蛋白表达的研究.实用肿瘤杂志，2004，19(4)：292-295.

136000 中国医科大学四平医院血液科

王晓华