糖尿病肾病合并膜性肾病模型的构建

邵丽媛 李 淼 卢雪红 吴 曼 罗 萍 (前郭县县医院血液透析室，吉林 松原 306)

随着对糖尿病肾病(DN)的研究不断深入，发现糖尿病(DM)患者合并的肾脏损害不一定都是DN。DM肾脏疾病(DKD)不仅包括传统意义上的DN，还包括DM合并的非DM性肾脏疾病(NDRD)〔1〕。本研究在构建DN大鼠模型、膜性肾病(MN)模型的基础上，创新性地构建DN伴MN大鼠模型，为进一步研究DM合并NDRD的机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 正常健康雄性Wistar大鼠，180～200 g，吉林大学基础医学院动物实验中心提供。随机将大鼠分为正常组(NC，n=10)，DN 组(n=10)，MN 组(n=15)，DN+MN组(DN+MN，n=20)。

1.2 主要试剂及仪器 小牛血清白蛋白(BSA，购自上海缘聚生物科技有限公司)，碳化二亚胺(EDC，国药集团)，链脲佐菌素(STZ，购自Sigma公司)，BM-V型自动组织包埋机(湖北省医用电子仪器厂)，半自动石蜡切片机(英国Thermo Shandon公司)，BX40型Olympus显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠MN模型 将无水乙二胺(EDA)67 ml溶于500 ml蒸馏水中，再加入6 mol/L盐酸350 ml，温度控制在25℃，将pH调整至4.75，加BSA 5 g溶于25 ml蒸馏水中，接着加EDC 1.8 g，继续维持原温度与pH值，均匀搅拌2 h。上述物质在4℃蒸馏水中透析48 h，最后冷冻干燥为结晶粉末，用聚丙烯酰胺等测定等电点(PI＞8.5即可)。C-BSA放冰箱备用。将C-BSA 5 mg溶于生理盐水中(配制浓度为10 mg/ml)，与等体积不完全弗氏佐剂乳化，大鼠皮下多点注射作预免疫。预免疫1 w后，开始正式免疫。每只大鼠每次给予C-BSA 16 mg/kg〔2〕尾静脉注射，3次/d，连续注射4 w。用尿蛋白测定试纸条检测尿蛋白⧺，则MN模型成功。

1.3.2 大鼠DM模型及DN模型的建立 随机选取大鼠，禁食16 h，腹腔注射新鲜配制的 STZ〔3〕(55 mg/kg，溶于 0.9% 的生理盐水中)一次，连续3 d检测血糖、尿糖，尿糖定性⧻以上、血糖＞13.8 mmol/L，并持续上述标准不变者，确定DM造模型成功。NC组注射等量的0.9%生理盐水。观察大鼠一般状态、饮食、饮水量、尿量及活动情况。DM模型成功后，继续检测大鼠血糖＞16.7 mmol/L、尿蛋白测定试纸条检测尿蛋白为(+～⧺)、尿微量白蛋白＞15 μg/ml，则 DN造模成功。

1.3.3 DN合并MN大鼠模型的制作 随机抽取成功造模的DN模型大鼠(n=20)，按1.2.1DN模型构建方法处理。共4 w。8 w后处死大鼠，处死前心脏采血、留取肾脏组织。

1.3.4 标本采集与检测 各组大鼠每周于处死前24 h置于代谢笼中收集24 h尿液，考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白定量。左侧肾脏称重，留取肾皮质于－80℃保存用于检测蛋白及RNA;右肾皮质，部分留取新鲜标本，取出后迅速制成冰冻切片，于4℃保存。用于免疫荧光检测部分置于10%甲醛内固定制作光镜标本，过碘酸雪夫(PAS)、高碘酸-六胺银(PASM)及胶原纤维(MASSON)常规染色。荧光显微镜及光镜下观察肾脏病理变化。

1.4 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行分析，数据以s表示，组间资料比较采用方差分析。

2 结果

2.1 一般状态 NC组大鼠普通饮食、饮水如常，大小便正常，活泼健壮，体毛有光泽。DN组24 h摄食量、饮水量大约为NC组的两倍，尿量明显增多，大便稀溏，体重明显减轻。MN组有不同程度的摄食减少、精神不振、尿量减少、身体消瘦、蜷缩、体毛失去光泽、大便稀烂等现象，部分出现少量腹水。DN+MN组大鼠出现精神不振，多饮、多食、多尿及体重减轻，一部分出现腹水及肉眼血尿，其中1只死亡。

2.2 各组24 h尿蛋白的变化 见表1。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量的变化( s ，g)

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量的变化( s ，g)

与NC组比较：1)P＜0.05

组别 n.16 DN 10 5.09±0.241) 16.7±0.431) 17.0±1.081) 16.3±6.251)MN 15 23.58±3.491)128.21±32.381)142.42±49.071)148.42±49.451)DN+MN19 27.18±3.871) 146.21±40.331) 150.45±45.671) 155.67±56.671)2 w 4 w 6 w 8 w NC 10 10.45±2.48 9.24±1.82 10.35±1.57 9.97±3

2.3 肾脏病理学改变 NC组大鼠肾脏病理正常;DN组大鼠肾脏表现为肾小球体积增大，肾小球系膜区弥漫性增宽，细胞外基质弥漫增多，可见毛细血管基底膜增厚及毛细血管腔闭塞;MN组肾小球毛细血管壁增厚、僵硬，偶见钉突形成，上皮下嗜复红物存在，小管内可见蛋白管型;DN+MN组大鼠肾小球体积增大，系膜细胞增生，系膜基质增多，弥漫性基底膜增厚，肾小管上皮细胞弥漫性颗粒样变性，局灶性空泡样变性，小管腔内可见蛋白管型。见图1。

图1 各组大鼠肾脏病理PAM染色(×400)

3 讨论

DN是引起终末期肾衰的重要原因，蛋白尿作为DN的临床表现，是DM进展到DN的一个重要标志，其排出量的多少预示着病情的严重程度。很多学者发现DM合并大量蛋白尿的患者经肾活检证实并非由DN所致，而是因为合并了原发性肾小球疾病，尤以合并MN居多〔4～6〕。对既存的DN以外的肾脏疾病进行积极而有效的治疗，可避免因为合并NDRD而导致肾功能迅速恶化。

在DN合并MN大鼠模型制作中，如何安排DN模型和MN模型建立的先后顺序是关键之处。STZ诱导的DM动物模型具有病情相对稳定、存活时间长等特点，继发的肾脏病变呈渐进性，常用于DN模型的进一步诱发和研究。由于DN大鼠比正常大鼠对C-BSA敏感，故而在DN大鼠模型基础上建立MN模型更加有效，时间更短。DN组大鼠外周血管细，免疫力降低，改用腹腔注射替代尾静脉注射C-BSA制备DN合并MN大鼠模型，其原理与C-BSA诱导MN大鼠模型的原理相似。

如何验证DN模型、MN模型、DN合并MN模型成功?DN模型的验证方法标准不一，本文采用杨亦彬等〔3〕的诊断标准只有持续的体内高血糖环境才能加速DN的形成，因此需每周监测大鼠血糖，均稳定高于16.7 mmol/L。DN组基本可模拟出人类2型DN的典型病理变化。DM大鼠血管改变在3个月时就已出现，但本模型中肾小管萎缩和间质纤维化病变不明显，这可能与时间有关。MN的成模标准：造模后大鼠出现消瘦，纳差，精神不振，活动减少，毛色枯槁，脱落，抓持反抗能力减弱，部分大鼠出现腹水，阴囊水肿;肾脏组织学检查显示，造模4 w后大鼠的肾小球基底膜呈不规则增厚，基质增多，上皮下嗜复红物存在，肾小管内可见蛋白管型。DN合并MN成模标准：病理表现为肾小球体积增大，肾组织出现系膜细胞增生、基质增多，弥漫性基底膜增厚，肾小球上皮细胞下嗜复红物存在，肾小管上皮细胞弥漫性颗粒样变性，小管内可见蛋白管型。通过肾脏病理可以判断动物模型制作是否成功。实验中需要注意的问题有：动物造模时间长，大约3个月，而DM大鼠抵抗力低下，为保证大鼠造模成功，要特别注意饲养环境，有清洁充足的水源、食物;DM大鼠尿量多，垫料潮湿，要勤换敷料;预防感染，腹腔注射、皮下注射及采血等侵入性操作前后，注意消毒;血糖＞35 mmol/L时，补充中效胰岛素;禁食后的大鼠，注射时候已经处于低血糖状态，造模4 h后根据血糖情况，腹腔注射20%葡萄糖以避免因注射时血糖过低导致大鼠死亡。在测24 h尿蛋白定量时，考虑到糖尿病大鼠24 h禁食容易出现低血糖死亡，采用留15 h尿量、换算其24 h尿蛋白总量的方法。

总之，本实验制备了DN、MN动物模型，并成功诱导出DN合并MN的动物模型，为进一步的机制研究奠定了基础。

1 KDOQI.Clinical practice guidelines and clinical practice recommendations for diabetes and chronic kidney disease〔J〕.Am J Kidney Dis，2007;49：122-54.

2 梁 静，孙兴旺，曹 灵，等.不同剂量阳离子化牛血清白蛋白对膜性肾病大鼠造模的影响〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2008;12(37)：7322-5.

3 杨亦彬，张 翥，苏克亮，等.链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病模型的方法学探讨〔J〕. 华西医学，2005;20(2)：299-300.

4 Bi H，Chen N，Ling G，et al.Nondiabetic renal disease in type 2 diabetic patients：a review of our experience in 220 cases〔J〕.Ren Fail，2011;33(1)：26-30.

5 Pham TT，Sim JJ，Kujubu DA，et al.Prevalence of nondiabetic renal disease in diabetic patients〔J〕.Am J Nephrol，2007;27(3)：322-8.

6 李 璇，孙雪莹，王 琼，等.链佐星-弗氏完全佐剂作用大鼠糖尿病肾病模型〔J〕.南京中医药大学学报，2008;24(4)：257-60.