柱层析法纯化灯盏乙素的研究

肖俊辉 姚 旭* 刘运美* 王小平 唐昌云 周 洋 郑 兴*

（1 南华大学附属第二医院，湖南 衡阳 421001；2 南华大学药学科研兴趣小组，湖南 衡阳 421001）

灯盏乙素又名黄芩素苷（scutellarin），即4'，5，6-三羟基黄酮-7-葡糖醛酸苷，是灯盏花治疗脑血管疾病所致瘫痪的主要有效成分，在灯盏花素中一般占90%左右。研究表明，灯盏乙素具有改善微循环，调节血脂，提高心肌功能，清除氧自由基等广泛的药理作用[1-4]。现在市售的灯盏乙素多为纯度为90%左右的粗品，为获得高纯度的灯盏乙素，我们分别以大孔树脂、聚乙酰胺、硅胶为填料，探讨通过柱层析法获得高纯度灯盏乙素的最佳方案。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（日本岛津公司LC2010A型）；电子分析天平BT25S（日本岛津公司）；旋转蒸发仪（BUCHI R-124）；CQ250超声波清洗器（上海必能信超声有限公司）；层析柱（2.5×40cm）。

市售灯盏乙素（云南植物药业有限公司）；灯盏乙素标准品（中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；硅胶100～200目，200～300目（中国医药上海化学试剂公司）；大孔树酯D-101，AB-8（北京慧德易科技有限公司）；聚乙酰胺30-60目（台州市路桥四甲生化塑料厂）；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。

1.2 填充材料的预处理

硅胶于105℃烤2h，置干燥器中冷却；大孔树脂用乙醇浸泡24h，再水洗至无醇味；聚乙酰胺乙醇浸泡24h后用10%的醋酸和5%的NaOH处理。

2 方 法

2.1 薄层色谱法（TLC）定性和半定量分析

实验采用玻璃板为载板，硅胶G为固定相，V（C4H8OH）∶V（CH3COOH）∶V（H2O）=4∶1∶5混合液为流动相，碘蒸气显色。

2.2 高相液相色谱法（HPLC）

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为V（CH3OH）∶V（0.1%H3PO4）=60∶40，流速为1.0mL/min，检测波长为335nm，柱温为室温，进样量为10μL[5-7]。

2.2.2 标准曲线的制备

精密称取灯盏乙素标准品10mg，于比色管中甲醇定容至10mL，即浓度为1mg/mL对照品溶液。分别取0.25、0.5、1、1.5、2.0、2.5mL稀释至10ml，配成0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL系列标准液，进样测得峰面积。以峰面积（Y）与进样浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y =1.0×107X-602 511，r=0.9981，线性范围25.00～250.00μg/mL。

2.2.3 精密度实验

精密量取0.05、0.1、0.2mg/mL的灯盏乙素标准品溶液按上述色谱条件，分别重复5次。计算RSD值分别为0.14%、0.18%、0.24%，表明测定方法精密度良好。

2.2.4 稳定性实验

精密量取0.1%标准品液分别与0、1、2、4、6、8h内进样测定。测得RSD值为0.32%，表明灯盏乙素样品液在8h内稳定。

3 结果与讨论

3.1 大孔树脂的动态吸附洗脱

取大孔树脂D-101，AB-8装柱，精密称取样品0.25g，置烧杯中，加NaHCO3/NaOH缓冲液5ml，60℃水浴加热搅拌至完全溶解，上样，用10%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至约5mL，加入10倍体积丙酮沉淀，静置30min，过滤，沉淀用40%丙酮搅拌溶解，待完全溶解后用稀盐酸酸化至pH=2，静置30min，过滤，滤渣水洗至中性，真空干燥。称重，HPLC检测纯度。按上述过程，大孔树脂D-101，AB-8各重复3次，求平均值。结果见表1。

3.2 聚乙酰胺的动态吸附洗脱

取30～60目聚乙酰胺装柱，精密称取灯盏乙素样品1.0g，上样，分别用不同浓度乙醇梯度洗脱。根据TLC监测结果，收集洗脱液。将洗脱液浓缩，真空干燥。称重，进行HPLC分析。按上述过程，重复3次，求平均值。结果见表1。

3.3 硅胶的动态吸附洗脱

通过薄层色谱法比较了不同比例的二氯甲烷、甲醇作流动相时，主成份的比移值Rf、杂质组份的比移值Rf′、比移值差ΔRf及相对比移值，结果发现当V（CH2Cl2）∶V（CH3OH）=5∶1时较适宜硅胶柱的动态吸附洗脱。

分别取100～200目和200～300目硅胶干法装柱，称取灯盏乙素样品0.25g，上样，V（CH2Cl2）∶V（CH3OH）=5∶1常压洗脱。根据TLC监测结果，收集洗脱液，浓缩，真空干燥。称重，HPLC分析。按上述过程，100～200目和200～300目各重复3次，求平均值。结果见表1。

表1 不同固定相吸附效果

由表1可以看出：硅胶和大孔树脂对灯盏乙素纯化效果均较好，但大孔树脂的产率明显较硅胶低，且操作步骤繁琐，易造成原料损失。因此该条件下大孔树脂用于灯盏乙素的分离精制存在缺陷，而用硅胶柱精制灯盏乙素有如下优点：①工艺流程简单，且纯化效果明显。②经200-300目的硅胶分离后，其纯度达到98%以上，且收率相对较高。

硅胶柱纯化前后成分变化的HPLC分析结果分别见图1、图2。

4 结 论

固定相为200～300目硅胶，流动相为V（CH2Cl2）∶V（CH3OH）=5∶1时，灯盏乙素能获得较好的纯度和收率，且该方法成本低，操作简单。

图1 未处理前样品的HPLC图谱

图2 经200～300目硅胶处理后样品的HPLC图谱

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