黄芪扶正汤联合顺铂对LewiS肺癌荷瘤小鼠的治疗作用

黄玉娥 李爱玲 罗伟强 高妙萍 陈国刚

（1 广州医学院第三附属医院药剂科，广东 广州510150；2 广州市荔湾区第三人民医院药剂科，广东 广州510380；3 广州市胸科医院药剂科，广东 广州510095）

人类进入工业化时代以来，恶性肿瘤尤其是肺癌，一直都威胁 着人类的健康。它5年生存率约为15%，其发病率及病死率仍在不断上升[1]。目前临床上对于肺癌的治疗并无理想的治疗手段，大多数采用化疗或放疗，在治疗的同时对人体将会产生巨大的副作用，如抑制人体白细胞数目，降低人体抗感染的能力等。有研究表明，经过三维放疗治疗的患者中仍然有30%左右出现不同程度的肺损伤[2]。化疗疗效肯定，但它毒副作用广泛且严重，对肿瘤患者的恢复极其不利，也损害了机体的免疫系统，导致肿瘤可能复发。近年来的生物靶向治疗药物虽然特异性强，不良反应低。但它价格昂贵。近年来中医在防治肿瘤方面的优势逐渐明显，中医西医相辅相成，充分发挥我国独有的防癌治癌特色和优势，延长生存期的目的[3,4]。

黄芪扶正汤这一经验方由黄芪、黄精、构祀、女贞子和灵芝组成，该五味中药均能不同程度的提高机体的免疫能力，但是未见该经验方用于抗肺肿瘤方面的报道。为了验证该方的抗肿瘤作用，我们以Lewis肺癌荷瘤小鼠为模型，观察其对肿瘤的发生以及转移的抑制作用，并比较该方对化疗药的减毒作用，为开发本方药新用途提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

近交es7BL/6纯系6～8周龄雄性小鼠（sPF级）46只，体质量介于16～20g，购于中山大学实验动物部，合格证号：粤实动证字2010034号。小鼠Lewis肺癌细胞株，购于中山大学医学院细胞中心实验室。

1.2 实验药物和试剂

采用黄芪、黄精、构祀、女贞子和灵芝按比例2∶1∶1∶1∶1制备黄芪扶正汤。组分各种药物均为同一批次统一购于本院中药房。采用水浸泡法，煮沸法等，得到粉剂放入4℃冰箱保存备用。用生理盐水将顺铂（齐鲁制药有限公司）配置为0.2mg/mL的溶液待用。DMEM培养基和RPMI- 1640购自北京索莱宝科技有限公司；小牛血清和胰蛋白酶购自杭州四季青生物技术公司；DMSO（二甲基亚矾）和Con-A购自美国AMRESCO公司。

1.3 细胞培养

根据文献[4], 将细胞置于含5%CO2，37℃恒温培养箱中培养，所用培养基为DMEM（10%小牛血清，100μ/mL青霉素，100μ/mL链霉素），待细胞进入对数生长后，经0.25%胰蛋白酶溶液消化传代，台盼蓝拒染法测定活细胞数，用无血清培养基调节细胞浓度为1×107个/mL，制成细胞悬液备用。

1.4 实验分组及给药

根据文献[4]，将接种后的小鼠随机分为五组，分别为空白组、模型组、顺铂组、黄茂扶正汤组、化疗+中药组。待小鼠成瘤后，腹腔注射顺铂2mg/kg治疗[5]，共给药5次；中药组每日灌服黄茂扶正汤溶液10mL/（kg•d），共14d；化疗+中药组两药用法同前；对照组给予等量的生理盐水灌胃。每天密切观察小鼠体质量变化，并记录肿瘤最长径（a）和最短径（b）。

1.5 标本采集

根据文献[4]，给药后第7天，腹腔给药麻醉小鼠，由尾静脉取血50μL，并分离眼球血血清。肿瘤标本：用眼科剪摘除肿瘤迅速称重记录后使用10%的中性甲醛溶液保存。肺标本：Boulns液固定小鼠肺24h，经无水乙醇漂洗。计数各肺叶表面的Lewis肺癌转移灶数，计算肺转移抑制率。骨髓有核细胞标本：来源于小鼠完整右侧股骨，用白细胞计数板载显微镜下计数洗液中骨髓有核细胞数

1.6 测定外周血白细胞数和骨髓有核细胞数

根据文献[5]，用白细胞计数板在显微镜下计数洗液中骨髓有核细胞数或外周血白细胞数，按下列公式计数/L=4个大方格内白细胞总数×10/4×20×106。

1.7 统计学分析

采用SPSSl3.0软件进行数据的统计学处理，计量资料用均数±标准差（mean±S）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-Kq检验法，计数资料的比较采用t检验。以P＜0.05认为有显著性差异。

2 实验结果

2.1 黄芪扶正汤可以抑制肿瘤的生长

各组小鼠在肿瘤细胞接种后第7天开始，右上肢背部可摸到直径约3～6mm。与空白对照组小鼠比较，其中模型对照组和化疗组小鼠出现活动及进食减少，精神萎靡不振等现象最为明显，中药组表现较轻。各组小鼠肿瘤逐日增大，增长速度最快的为模型对照组，最慢的为化疗+中药组（图1，表1）。并且，中药组瘤重较模型对照组减轻（P＜0.05）；化疗组、中药组、化疗+中药组的抑瘤率分别是52.0%，387%，68.96%（表2，图2）。

图1 各组小鼠的肿瘤生长曲线

表1 各实验组小鼠体质量增长的变化（均数±标准差）

表2 治疗后各组Lewis肺癌小鼠瘤重和抑瘤率的比较（均数±标准差）

2.2 黄芪扶正汤抑制肿瘤肺转移灶的形成

从表3可以看出，相对于模型对照组而言，中药组可减少肺转移灶的形成，中药加化疗组肺转移数最少。

2.3 黄芪扶正汤促进小鼠白细胞和骨髓有核细胞增生

图2 治疗后各组Lewis肺癌小鼠瘤重的比较

表3 治疗后各组Lewis肺癌小鼠瘤重和抑瘤率的比较（均数±标准差）

表4 各实验组对小鼠白细胞数和骨髓有核细胞数的影响（均数±标准差）

如表4所示，相对于模型对照组而言，接受顺铂治疗组外周血白细胞和骨髓有核细胞数下降（P＜0.05），而同时接受化疗和中药治疗组白细胞数和有核细胞数均有升高（P＜0.05）。

3 讨 论

肿瘤是机体自身细胞在各种内外致癌因素作用下发生转化产生的。肿瘤细胞在生物学特征及免疫学方面与机体正常细胞不同，必然导致机体的免疫应答，主要是细胞免疫。肺癌患者体内常呈现免疫功能抑制状态[6]，因此肺癌免疫治疗获得了极大的关注。我国近年来在中草药治疗肺癌方面，取得了较大的突破。动物实验和临床试验表明[7]，黄芪扶正汤能够提高小鼠的免疫功能和改善老年人的细胞及体液免疫功能。目前化疗仍然是治疗肿瘤的主要手段，但是化疗药物往往会对正常组织或细胞均有不同程度的抑制作用。化疗药物的毒副作用限制了该类药物在临床上疗效的进一步提高。因此临床上迫切需要利用药物联合应用来提高药物的疗效和降低化疗药物的毒副作用。

研究表明黄芪和黄精均可以通过增加骨髓造血干细胞数目和外周白细胞数目来增加机体的免疫能力[7-9]，构祀也能明显促进小鼠造血功能[10,11]。本中药复方成分为黄芪、黄精、构祀、女贞子、灵芝五味中药，虽然每味中药均能改善机体的免疫功能，但是复方是否也能从提高自身免疫能力的角度来抑制肿瘤的发生发展以及减弱化疗药物的毒副作用呢？本实验结果显示中药组的瘤重减轻（P＜0.05），瘤体积减小、肺转移数减少 （P＜0.05）。同时中药组肿瘤生长速度减慢。说明应用黄芪扶正汤对肿瘤生长和肺部转移有一定的抑制作用。并且我们采用了顺铂作为实验的阳性对照。在实验中观察各组小鼠用药后的基本情况。结果提示，化疗组小鼠出现精神萎靡，活动迟缓等现象，中药组以及中药组+化疗组小鼠情况较好，无明显消瘦或聚集现象。可能原因是由于化疗药物的不良反应导致小鼠进食减少，体质量增加减少，而联合中药治疗后，明显提高化疗效果。说明黄芪扶正汤对化疗药物具有解毒作用，联合用药可以增加化疗药物的疗效。结果同时提示，应用顺铂治疗后，小鼠的白细胞和骨髓有核细胞被抑制，表现为细胞数目下降，但是联用黄芪扶正汤后，外周血白细胞数和骨髓有核细胞数均高于顺铂单独使用组，提示该中药复方可以减轻化疗药物的毒副作用。但是黄芪扶正汤具体抑制肿瘤的机制仍然需要进一步治疗。

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