类黄酮化合物对DU145前列腺癌细胞的抑制作用

张 强，邱洪斌(佳木斯大学公共卫生学院， 黑龙江 佳木斯 154007)

丛玉婷(大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连116023)

尹相林(佳木斯大学公共卫生学院， 黑龙江 佳木斯154007)

类黄酮化合物对DU145前列腺癌细胞的抑制作用

张 强，邱洪斌(佳木斯大学公共卫生学院， 黑龙江 佳木斯 154007)

丛玉婷(大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连116023)

尹相林(佳木斯大学公共卫生学院， 黑龙江 佳木斯154007)

目的：观察类黄酮化合物对前列腺癌DU145细胞的抑制作用。方法：采用光学显微计数法，考察不同浓度染料木黄酮、木犀草素以及槲皮素对DU145细胞的增殖抑制活性；采用流式细胞仪，分析和比较上述3种化合物对DU145细胞周期停滞和细胞凋亡的诱导作用。结果：染料木黄酮、木犀草素以及槲皮素均能抑制DU145细胞增殖，并诱导该细胞发生S期停滞和细胞凋亡，三者的活性顺序是：染料木黄酮gt;木犀草素gt;槲皮素。结论：类黄酮化合物对DU145细胞具有显著的抑制活性。

类黄酮化合物；前列腺癌；细胞凋亡；抗癌活性

前列腺癌是一种浸润性较强的恶性肿瘤，在导致男性死亡的肿瘤中仅次于肺癌[1]。西方国家的前列腺癌发病率明显高于亚洲国家，形成这一差异的重要因素之一是东西方饮食习惯的不同[2]。在包括我国在内的亚洲国家人群中，植物性食物的摄入量明显高于西方国家，而植物性食物中的类黄酮化合物含量极为丰富[3]。因此，类黄酮化合物与前列腺癌之间的关系，已成为目前人们十分关注的问题。针对这一问题，我们以DU145细胞为前列腺癌体外研究模型，探索染料木黄酮、木犀草素和槲皮素等膳食中含量丰富的类黄酮化合物，对DU145的细胞增殖、细胞凋亡以及细胞周期循环的影响，进而明确类黄酮化合物对前列腺癌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

染料木黄酮(纯度gt;95%)购自Sigma公司；槲皮素、木犀草素(纯度均gt;95%)购自南京青泽医药科技发展有限公司；碘化丙锭(PI)、二甲基亚砜(DMSO)以及RNase购自北京索莱宝生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。

1.2细胞培养

人前列腺癌DU145细胞(购自北京协和细胞中心)，于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的RPMI1640(Gibco)培养液中常规(37℃，5%CO2)培养。

1.3细胞增殖抑制检测

将细胞接种于24孔细胞培养板中，培养24h后，分别加入染料木黄酮、木犀草素、槲皮素的 DMSO (lt;0.1%)溶液。作用浓度为100、80、40、20μmol/L，作用时间均为24h。0.1%DMSO细胞处理组分别作为阴性对照。倒置显微镜下观察计数，研究各化合物在不同浓度下对细胞的增殖抑制作用。

1.4细胞周期检测

将细胞接种于6孔中，分别加入浓度为80μmol/L的类黄酮化合物作用24h后，胰酶消化收集细胞；PBS缓冲液清洗3次，800g离心6min，去上清；加1ml PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清；用300μl的PBS 重悬细胞，将细胞逐滴加入700μl 预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70%，4℃避光固定过夜；800g 离心10min，去上清；加2mg/ml的PI 至终浓度50μg/ml，避光孵育30min，以PI 荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目。

1.5流式细胞术测定细胞凋亡率

接种于6孔细胞培养板中，培养24h后，分别加入浓度为80μmol/L的类黄酮化合物作用24h。按照Annexin V-FITC/PI试剂盒厂家说明进行细胞染色后，上流式细胞仪进行分析。

1.6统计学分析

2 结 果

2.1类黄酮化合物对DU145细胞的增殖抑制活性

图1 类黄酮化合物对DU145细胞的增殖抑制作用

采用光学显微计数法，考察不同浓度染料木黄酮、木犀草素以及槲皮素对DU145前列腺癌细胞的增殖抑制活性。结果如图1所示，3个类黄酮化合物对DU145细胞均表现出增殖抑制作用，这种抑制作用呈剂量依赖关系。其中，染料木黄酮对DU145细胞增殖的抑制活性相对最强，其次是木犀草素，槲皮素相对活性较弱。

2.2类黄酮化合物对DU145细胞周期循环的影响

采用流式细胞仪，分析比较染料木黄酮、木犀草素以及槲皮素对DU145前列腺癌细胞周期循环的影响。结果如图2所示，3个类黄酮化合物作用DU145细胞后，能够诱导DU145细胞周期循环发生S期停滞。其中，染料木黄酮对DU145细胞S期停滞的诱导活性相对最强，其次是木犀草素，槲皮素活性相对较弱。

图2 类黄酮化合物对DU145细胞周期循环的影响

2.3类黄酮化合物诱导DU145细胞凋亡的流式细胞仪分析

通过PI和FITC-Annexin V标记DU145细胞，进行细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果如图3所示，3个类黄酮化合物作用DU145细胞后，凋亡DU145细胞的比例显著增加。其中，染料木黄酮对DU145细胞的凋亡诱导活性相对最强，其次是木犀草素，槲皮素活性相对较弱。

图3 类黄酮化合物对DU145细胞凋亡的影响

3 讨 论

我们通过光学显微计数发现，3种类黄酮化合物(染料木黄酮、木犀草素、槲皮素)均能抑制DU145前列腺癌细胞增殖，且抑制效果与化合物的作用浓度呈明显正相关。这一结果与前期相关研究具有一定的相似性[4-5]。在比较3种类黄酮化合物的抗癌细胞增殖活性时，可以发现染料木黄酮的抑制活性相对最强，其次是木犀草素，槲皮素相对活性较弱。由此表明，异黄酮结构相对黄酮结构，对前列腺癌细胞具有更强的抑制活性。

癌细胞的增殖速度取决于癌细胞分裂的速度，而细胞周期循环的状态直接反映了癌细胞分裂速度的变化。我们通过流式细胞仪研究发现，染料木黄酮、木犀草素、槲皮素能够诱导DU145细胞周期循环停滞于S期。以往研究认为，类黄酮化合物诱导的细胞周期停滞发生于G0/G1期和G2/M期[6-7]。此次发现类黄酮化合物引发的S期细胞周期停滞，对于完善类黄酮化合物抗癌机制理论具有重要价值。另外，我们通过流式细胞仪分析了DU145细胞经化合物作用后的细胞凋亡情况，结果显示3种类黄酮化合物均能够诱导DU145发生细胞凋亡。这一结果与以往研究发现具有高度的相似性[8-9]。

综上所述，通过分析3种结构不同的类黄酮化合物，对前列腺癌细胞DU145细胞的抑制作用，不仅明确了类黄酮化合物抗前列腺癌的优势分子结构，而且发现了类黄酮化合物能够诱导前列腺癌细胞发生S期细胞周期停滞，从而拓宽了对类黄酮化合物抗癌机制的了解。

[1]Khan N，Adhami V M，Mukhtar H. Apoptosis by dietary agents for prevention and treatment of prostate cancer[J]. Endocr Relat Cancer，2010，17(1)： 39-52.

[2]Chan F L，Choi H L，Chen Z Y，et al. Induction of apoptosis in prostate cancer cell lines by a flavonoid，baicalin[J]. Cancer Lett，2000，160(2)：219-228.

[3]Rosenberg Z R S，Jenkins D J，Brown T J，et al. Flavonoids can block PSA production by breast and prostate cancer cell lines[J]. Clin Chim Acta,2002，317(1/2)：17-26.

[4]Samarghandian S，Afshari J T，Davoodi S. Chrysin reduces proliferation and induces apoptosis in the human prostate cancer cell line[J]. Clinics (Sao Paulo)，2011，66(6)：1073-1079.

[5]Nair H K，Rao K V，Aalinkeel R，et al. Inhibition of prostate cancer cell colony formation by the flavonoid quercetin correlates with modulation of specific regulatory genes[J]. Clin Diagn Lab Immunol，2004，11(1)：63-69.

[6]Zhang Q，Zhao X H，Wang Z J. Flavones and flavonols exert cytotoxic effects on a human oesophageal adenocarcinoma cell line (OE33) by causing G2/M arrest and inducing apoptosis[J]. Food Chem Toxicol，2008，46(6)： 2042-2053.

[7]Zhao R，Xiang N，Domann F E，et al. Effects of selenite and genistein on G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human prostate cancer cells[J]. Nutr Cancer，2009，61(3)：397-407.

[8]Aalinkeel R，Bindukumar B，Reynols J L，et al. The dietary bioflavonoid，quercetin，selectively induces apoptosis of pro-state cancer cells by down-regulating the expression of heat shock protein 90[J]. Prostate，2008，68(16)：1773-1789.

[9]Liu K C，Yen C Y，Wu R S，et al. The roles of endoplasmic reticulum stress and mitochondrial apoptotic signaling pathway in quercetin-mediated cell death of human prostate cancer PC-3 cells[J]. Environ Toxicol，2012 Mar 20. doi：10.1002/tox.21769.

[编辑] 一 凡

R737.25；O629

A

1673-1409(2012)05-R001-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.05.001

2012-04-15

黑龙江省教育厅面上项目(12511567)

张强(1979-)，男，山东济南人，助理研究员，博士，硕士生导师，主要从事营养与食品卫生学研究。