水蛭提取方法及生理活性的研究

王 艳，杨培民，代 龙，刘国飞

(1.山东中医药大学，山东 济南 250355;2.北京和润创新医药科技发展有限公司，北京 100021)

水蛭为临床常用中药，广泛应用于各种血瘀症，《中国药典》记载水蛭具有破血通经，逐瘀消癓等功效［1］。目前水蛭临床一般以原粉、水煎煮、水煎醇沉等方法应用，存在服用量大、易被微生物污染等缺点。现代药理研究表明，动物类药材发挥作用的主要为其小肽类成分［2］，因此，笔者拟采用酶解方法得到其小肽类成分，然后与上述几种常规方法所得提取液比较生理活性。

1 材料

1.1 动物

Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重(200±20)g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物许可证号为:SCXK(鲁)20090056。

1.2 仪器

高速万能粉粹机，北京市永光明医疗仪器厂;W-O型恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司;DZF-605型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 试剂及药品

胃蛋白酶(酶活力1∶3 000，批号:091015)、胰蛋白酶(酶活力1 000～1 500 u/mg，批号:091105)，均购自上海蓝季科技发展有限公司;牛纤维蛋白原(供凝血酶效价测定用，批号:140626-2001009)，购自中国药品生物检定所，临用前配制为7mg/mL溶液;凝血酶(500 U)，购自浙江杭康药业有限公司，临用前配制为10 U/mL溶液;琼脂糖，购自北京奥博星生物技术有限责任公司;考马斯亮蓝R-250，购自上海展云化工有限公司，临用前配制为0.05%溶液;其余试剂均为分析纯;

水蛭购自济南建联中药店，经本校周凤琴教授鉴定系水蛭科动物蚂蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全体，60℃真空干燥，粉碎成80目细粉，备用。

2 方法

2.1 样品的制备

2.1.1 匀浆提取 取水蛭细粉100 g，加10倍水匀浆，持续10 min，取出，离心，上清液浓缩至含生药量0.2 g/mL，滤过，即为匀浆液。

2.1.2 水煎煮提取 取水蛭细粉100 g，加10倍水匀浆，持续10 min，取出，煮沸30 min，离心，残渣再加10倍水煮沸30 min，离心，合并上清液，浓缩至含生药量0.2 g/mL，滤过，即为水煎煮液。

2.1.3 水煎醇沉提取 取水蛭细粉100 g，加10倍水匀浆，持续10 min，取出，煮沸30 min，离心，残渣再加10倍水煮沸30 min，离心，合并上清液，加入乙醇使含醇量达70%，静置12 h，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至含生药量0.2 g/mL，滤过，即为水提醇沉液。

2.1.4 胃蛋白酶酶解提取 取水蛭细粉100 g，加10倍水匀浆，持续10 min，取出，煮沸15 min，冷至40℃，调pH至2.0，加入药材量1%的胃蛋白酶，40℃保温酶解4 h，取出，煮沸30 min，离心，取上清液，浓缩至含生药量0.2 g/mL，微孔滤膜滤过，即为胃蛋白酶酶解液。

2.1.5 胰蛋白酶酶解提取 取水蛭细粉100 g，加10倍水匀浆，持续10 min，取出，煮沸15 min，冷至40℃，调pH至8.0，加入药材量1%的胰蛋白酶，40℃保温酶解4 h，取出，煮沸30 min，离心，取上清液，浓缩至含生药量0.2 g/mL，滤过，即为胰蛋白酶酶解液。

2.1.6 仿生酶解提取 取水蛭细粉100 g，加10倍水匀浆，持续 10 min，取出，煮沸 15 min，放冷至40℃，调pH至2.0，加入药材量1%的胃蛋白酶，40℃保温酶解1 h，调pH至8.0，加入药材量1%的胰蛋白酶，40℃保温酶解3 h，取出，煮沸30 min，离心，取上清液，浓缩至含生药量0.2 g/mL，滤过，即得仿生酶解液。

2.2 得膏率的测定

取提取液各25mL，浓缩，干燥，计算得膏率。

2.3 抗凝活性

凝血酶原时间(PT)法［3］:大鼠腹腔静脉取血，3.8%枸橼酸钠(1∶9)抗凝，混合后，以3 000 r/min 离心15 min，取上清液，得到贫血小板血浆，分别取血浆0.1mL，加入样品液0.1mL，混匀，37 ℃保温30 min，再加入已预热至37℃的凝血酶溶液(10 U/mL)0.2mL，混匀，记录出现絮状沉淀所需时间。

2.4 溶纤活性

取琼脂糖0.8 g，加入磷酸盐缓冲液(pH 7.6)100mL，加热使溶解，冷却至55℃，加入纤维蛋白原溶液(7 g/mL)8mL及凝血酶溶液(10 U/mL)5mL，混匀，立即倒入已预热的培养皿中，待冷却后转移至7℃冰箱中放置20 min，用直径0.5 cm打孔器打孔。每个孔中均加入不同上述样品液20μL，以生理盐水、磷酸盐缓冲液(pH 7.6)做空白对照，于37℃培养箱中培养22 h。取出，用考马斯亮蓝R-250染色20 min，脱色液脱色，观察纤维蛋白溶圈，记录溶圈垂直直径［4］。

2.5 大鼠凝血时间(CT)及静脉血栓重量(TW)

取Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重(200±20)g，随机分为7组，每组10只，按表3分组。样品液组灌胃给药，1次/d，给药剂量均为相当于生药量 0.4 g/kg。

空白对照组灌胃给予同体积生理盐水，连续7d。末次给药后1 h，各组动物腹腔注射2.0%戊巴比妥钠麻醉，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下穿一丝线结扎下腔静脉管，造成瘀血，关闭腹腔。6 h后，用内径为1 mm的玻璃毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细管血柱达5 mm，每隔30 s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝，计算毛细管采血到出现血凝丝时间，即为凝血时间。再次打开腹腔，于结扎下方2 cm处夹闭血管，纵行剖开，取出血栓，记录血栓重量［5-6］。

3 结果

3.1 各种提取方法对得膏率的影响

结果见表1。

3.2 各种提取方法对抗凝活性、溶纤活性的影响

结果见表2。匀浆液、水煎煮液、水煎醇沉液组抗凝活性与空白对照组有显著性差异(P＜0.05);各酶解组PT较匀浆液组有较大延长，与空白对照组相比有极显著性差异(P＜0.01)，其中胃蛋白酶酶解液组与匀浆液组相比有显著性差异(P＜0.05)，仿生酶解液组与匀浆液组相比有极显著性差异(P＜0.01)。匀浆液、水煎煮液、水煎醇沉液组纤溶活性与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05);各酶解液组纤溶活性与空白对照组相比有极显著性差异(P＜0.01)，其中仿生酶解液组与匀浆液组相比有极显著性差异(P＜0.01)。

表2 抗凝活性、溶纤活性的测定结果(±s，n=10)Tab.2 Result of anticoagulant and thrombolysis(±s，n=10)

与空白对照组比较:1P＜0.05，2 P＜0.01;与匀浆组比较:3P＜0.05，4 P＜0.011P＜0.05，2 P＜ 0.01 vs control group;3P＜ 0.05，4P＜ 0.01 vs homogenate group

组 别 PT/s 溶纤活性/mm匀浆液 23.15±2.451 8.7±2.11水煎煮液 24.67±2.271 10.6±1.61水煎醇沉液 22.35±3.161 10.9±1.61胃蛋白酶酶解液 31.47±2.532，3 14.9±1.82，3胰蛋白酶酶解液 29.65±1.952 14.5±2.12仿生酶解液 45.12±2.562，4 20.9±2.12，4空白对照液15.49±1.85 5.1±0.2

3.3 提取方法对大鼠CT及TW的影响

结果见表3。匀浆液、水煎煮液、水煎醇沉液组CT、TW与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05);各酶解液组CT、TW与空白对照组相比有极显著性差异(P＜0.01)，其中胰蛋白酶酶解液组CT、TW与匀浆液组相比均有显著性差异(P＜0.05)，仿生酶解液组CT、TW与匀浆液组相比有极显著性差异(P＜0.01)。

表3 大鼠CT及TW测定结果(±s，n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s，n=10)

表3 大鼠CT及TW测定结果(±s，n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s，n=10)

与空白对照组比较:1 P＜0.05，2 P＜0.01;与匀浆液组比较:3 P＜0.05，4 P＜0.011P＜0.05，2P＜ 0.01 vs control group;3P＜ 0.05，4P＜ 0.01 vs homogenate group

煎醇沉液组蛋白酶酶解液组 105.30±13.272 18.73±3.062，3胰蛋白酶酶解液组 111.81±21.562，3 17.47±2.142，3仿生酶解液组 160.57±21.262，4 14.35±2.682，4空白对照组61.85±11.24 21.34±2.96

4 讨论

水蛭为贵重药材，一般的匀浆法、水煎煮、水煎醇沉等工艺的得膏率较低，其药材利用率低，提取后的药渣仍有较大活性;胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解得膏率稍有增加，但仍不能使药材得到较好的利用;仿生酶解法的得膏率高，酶解后的药渣基本没有活性，能够较好的利用药材，是理想的水蛭提取方法。

水蛭药材细粉经匀浆后，为使大分子蛋白受热变性，破坏其空间结构，从而易于蛋白质的水解，故先煮沸15 min。

本研究创新性提出，模拟人体消化过程，对动物类药材采用先以胃蛋白酶酶解、再以胰蛋白酶酶解的仿生酶解方法。参考文献［7-8］，确定本实验中胃蛋白酶的反应条件为40℃，pH 2.0，时间1 h;胰蛋白酶反应条件为40℃，pH 8.0，时间3 h。

朱正光等［9］研究发现，水蛭水煎液及其醇溶部分含抗凝活性物质，水煎液及其非醇溶部分含纤溶活性物质。本文采用仿生酶解的方法，将水蛭中的大分子蛋白酶解成水溶性的小分子肽，所得的酶解液同时具有抗凝及纤溶活性，而且较水煎液的活力更强，可更大程度提高生物利用度，降低毒副反应发生率。

水蛭细粉直接口服，只有少部分经胃肠道消化吸收，大部分以原型排出体外，大大浪费药材。而经体外仿生酶解后，将大分子的蛋白直接降解为小分子的肽，与人体经自身胃肠道消化吸收的物质相同，能直接吸收入血，生物利用度高，抗凝血、溶栓作用等生理活性更强，而且比一般的酶解方法更优，说明对水蛭进行体外仿生酶解得到小肽是一种极好的提高药物疗效的方法。

［1］中国药典［S］.一部.2010:77.

［2］Shimonishi Y.Peptide Science-Present and Future［M］.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers，1999:436-441.

［3］徐淑云.药理学实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2001:1270.

［4］Astrup T，Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952，40:346-351.

［5］徐 西，卢建秋，王硕仁，等.水蛭不同提取物抗凝作用的实验研究［J］.北京中医药大学学报，1994，17(3):36-38.

［6］王 征，陈晓光，吴 岩.土鳖虫溶栓酶抗凝血及抗血栓作用的实验研究［J］.中国实验诊断学，2007，11(9):1143-1145.

［7］钱 方，邓 岩，刘 阳，等.胃蛋白酶水解大豆蛋白的研究［J］.中国乳品工业，2001，29(3):10-13.

［8］黄开华，周艳明，吴 畏，等.胰蛋白酶酶解鹿血条件的优化［J］.湖北农业科学，2007，46(2):302-305.

［9］朱正光，吴曙光，孙燕荣.水蛭水煎液抗栓作用机制的体外实验研究［J］.中国生化药物杂志，2001，22(5):229-231.