饲喂十字花科类植物对生鲜牛乳中硫氰酸钠含量的影响研究

吴剑平，张 鑫，顾 欣，李丹妮，严 凤，方丝芸

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

牛乳中含有丰富的营养物质，为微生物提供了良好的生长环境，因此牛乳极易腐败变质。在牛乳中添加硫氰酸钠后可有效抑菌、保鲜及延长牛乳的保存期，但是，硫氰酸钠也是毒害品，过量摄入会对人体造成危害，2008年12月卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第一批)》中明确规定硫氰酸钠属于违法添加物质。据文献报道［1-2］，硫氰酸钠作为硫代糖苷和生氰糖苷的代谢产物而普遍存在于生鲜牛乳中，十字花科类植物因为富含硫代糖苷而可能成为非人为添加的生鲜牛乳中硫氰酸钠的主要来源之一。我国奶牛作为青饲料经常饲喂的十字花科类植物包括花椰菜、卷心菜和一些甘蓝菜的茎叶，油菜花属于十字花科类芸苔属，其榨油后的菜籽饼也被常用作奶牛的蛋白补充饲料。因此，有必要研究饲喂十字花科类植物对生鲜牛乳中硫氰酸钠含量的影响，以确定生鲜牛乳中非人为添加的硫氰酸钠含量本底值。

目前已建立了高效液相色谱法与毛细管色谱法检测牛奶中硫氰酸钠含量，其中高效液相色谱法具有定量准确、专一性强的特点［3-4］。该方法可适用于生鲜乳和巴氏灭菌成品乳，检测限可达到0.2 mg/kg，定量范围0.5 ～50 mg/kg，精确度 ＜10%，回收率＞90%。本研究通过该方法检测生鲜牛乳中的硫氰酸钠含量，通过对所得含量数据进行分析得到饲喂十字花科类植物对生鲜牛乳中硫氰酸钠含量的影响规律。

1 仪器、材料与试药

1.1 仪器 Waters高效液相色谱系统(2695-2998二极管阵列检测器，Empower®色谱工作站);高速冷冻离心机(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER);AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司;减压旋转蒸发仪(B-490，BUCHI);十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(Agela-ASB®C18，250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.2 材料与试药 碱性氧化铝SPE固相萃取柱(Agela-Cleanert® ，1000 mg ×6 mL);硫氰酸钠(98.5%，ALDRICH);磷酸(分析纯);三乙胺(分析纯);乙睛(色谱纯);甲醇(色谱纯);正丙醇(分析纯);去离子水(自制，电阻率＞10 MΩ·cm)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agela-ASB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为磷酸盐缓冲液∶甲醇=95∶5;柱温30℃;流速0.8 mL/min;检测波长228 nm;进样量10 μL。在上述色谱条件下，对空白、标准工作溶液和样品溶液进行系统适用性试验，典型色谱图如图1所示。

图1 典型色谱图

2.2 前处理条件 精密量取样品5.00 mL，置50 mL具塞离心管中，加入乙睛15 mL，密塞强烈振摇提取3 min后，至高速冷冻离心机中，4℃下8000 r/min离心3 min，小心取出全部上层清液，过碱性氧化铝SPE柱，挤干，收集全部流出液于100 mL梨型瓶中，加入1 mL正丙醇，置60℃恒温水浴中减压旋转蒸发至干，精密加入1.00 mL磷酸盐缓冲液，振荡溶解后，置2 mL TIP离心管中，14000 r/min离心3 min脱脂后取水层溶液过 0.45 μm滤膜，待测。

2.3 动物实验

2.3.1 实验动物的选取与分组 选用健康的产奶乳牛20头，产奶阶段、产奶量、体重、胎次和年龄基本相近，分为空白组、卷心菜叶组、花椰菜叶组、2倍花椰菜叶组，每组各5头，记录每头奶牛的编号，在开始试验前停止饲喂含十字花科类植物的青饲料1个月。

2.3.2 实验动物的饲喂 各实验组除青饲料以外其他日粮相同，每日分三次定时饲喂(凌晨3：00，上午10：00，午后17：00)，其中精饲料每头份每餐4 kg，配方为玉米48%、大麦10%、麸皮5%、玉米皮8%、豆粕9%、DDGS 15%、磷酸钙2%、苏打1.5%、碳酸钙1.5%、食盐1%;粗饲料每头份每餐6 kg，主要为干牧草与干花生茎叶。青饲料依据组别各不相同，具体每餐每头份饲喂情况如表1所示。

表1 实验动物每餐每头份饲喂量表

2.3.3 试样的采集 采用人工挤奶方式，每天进行三次采奶，具体时间为每次投料饲喂之后。挤奶前对每个乳头进行消毒液消毒，并将消毒液擦拭干净后进行挤奶，弃去每个乳区的前20 mL乳液，每个乳头分别采样50 mL，混合均匀后进行封装。样品使用保温箱与冰袋进行冷藏运输，采样当日进行含量测定。

2.3.4 组内个体差异的排除 对卷心菜叶组5头牛分别进行了连续5 d早中晚共计15次采样测定，其结果见图2。将每次采样的均值作为基准大部分数据点都落在其正负3倍标准偏差范围内，该结果说明，该组参与试验的牛中除了有4个数据点未落在3倍标准偏差范围内的B4号牛都基本处于正常情况，没有显著的组间差异，其含量可以用除B4号牛之外的4头牛所产生鲜乳的含量均值进行分析，其他三组也以相同方法进行数据处理。

图2 组内个体差异图

2.3.5 日内差异的排除 对B组饲喂卷心菜叶的连续5 d日间三次所采得奶样进行了含量测定，将其含量均值作图，其结果见图3。所得结果表明，同一天内早中晚三次采样的数据没有超过同组当日均值的正负3倍标准差范围，其差异并不显著，而大部分情况下中午所采集的奶样接近均值，因此可以取中午所采集点的数据表征当日含量值。

图3 日内个体差异图

2.3.6 4组加量饲喂试验 对所有进行试验的4组奶牛停止饲喂青饲料一个月后，按照饲喂计划开始加量饲喂试验，取各组中午11：00饲喂之后所采生鲜乳进行高效液相色谱法检测其中硫氰酸钠含量，取没有异常情况的样品含量均值与标准差作图，其结果见图4。所得结果表明，通过比较每组当日含量均值及其加减标准差后的范围，饲喂十字花科类植物的B、C、D三组的乳中硫氰酸钠含量显著高于空白对照组;且其加减标准差后的范围也不与之有重叠，三组中饲喂卷心菜叶的B组乳中硫氰酸钠含量显著低于饲喂花椰菜叶的C组与D组;C组与D组相比，D组乳中硫氰酸钠含量的上升速度较快，但是在6 d以后两组的乳中硫氰酸钠含量趋于稳定后，含量接近且其加减标准差的范围重叠，因此其差异并不十分显著。

图4 4组加量饲喂试验(各个时间点的SD值)

2.3.7 体内消除试验 饲喂8 d后饲喂花椰菜叶的C组与D组乳中的硫氰酸钠含量趋于稳定且其含量趋同。从第9天开始对D组进行停止饲喂花椰菜叶的体内消除试验，同时对继续按时按量饲喂花椰菜叶的C组和空白对照组进行采样测定，所得结果见图5。通过比较每日含量均值与其加减标准差的范围，所得结果表明停止饲喂花椰菜叶3 d后，D组乳中硫氰酸钠含量相比正常饲喂的C组有明显下降，当到达5 d之后D组的含量均值到达第一个平台期，当到达9 d后其含量又再次快速下降，到11 d又达到第二个平台期，且其含量值与空白对照组A组的含量趋同。

图5 消除规律图(各个时间点的SD值)

3 讨论

研究表明，十字花科类植物富含产生硫氰酸盐的生氰糖苷和异硫糖苷，云苔属类植物可达100 mg/kg，甘蓝类植物也可达到 250 mg/kg［6］，但未有关于奶牛饲喂十字花科类植物对产奶中硫氰酸钠含量影响的研究。据国外文献报道，南美洲个体奶牛间的生鲜乳中硫氰酸钠含量在2.3～35 mg/kg范围内，其中未经人为添加的散装生鲜乳中硫氰酸钠含量大约为8 mg/kg［7］，而一般采用乳过氧化酶体系进行保鲜处理的生鲜乳中需要人为添加15 mg/kg以上。因此，在实际生产中生鲜牛乳中非人为添加的硫氰酸钠含量应在2～15 mg/kg范围内，而饲喂十字花科类植物作为青饲料其每顿的饲喂量难以超过5 kg，试验中若再增加饲喂量，容易造成奶牛消化不良拉稀。通过对乳中硫氰酸钠含量的安全评价可知［1］，乳中硫氰酸钠含量在20 mg/kg以内是安全的，因此从本文的研究结果看，按正常量饲喂十字花科类植物不会造成生鲜牛乳中硫氰酸钠含量超过正常水平。

在相同饲喂条件下，同组正常乳牛所分泌的乳中硫氰酸钠含量应符合随机分布，因此其中个体含量落在其组内均值的正负3倍标准差范围内的概率应大于99.73%［5］，因此认为其中超出范围的点偏离了组群的正常水平，判定为异常数据点，而当某试验动物连续出现异常数据时应该舍弃该动物所提供的实验数据。正是基于此原理对试验数据进行了组内个体差异和日内差异的消除，确定了加量饲喂试验与体内消除试验的数据采集方式。

通过加量饲喂试验可知，当同样处于停止饲喂青饲料的奶牛开始饲喂十字花科类植物后其乳中硫氰酸钠含量明显高于仍然停喂青饲料的空白对照组，说明饲喂十字花科类植物作为青饲料可使生鲜牛乳中硫氰酸钠含量提高;在饲喂量相同的情况下，花椰菜叶组的乳中硫氰酸钠含量明显高于卷心菜叶组，说明饲喂不同类型的十字花科类植物对乳中硫氰酸钠含量的影响不同，花椰菜叶相比卷心菜叶可以使乳中硫氰酸钠含量提高更多;在同样饲喂花椰菜叶的两组中，以两倍于平时饲喂量饲喂的D组乳中硫氰酸钠含量升高较快，但是当其含量升高至趋稳后，两者的含量均达到6～7 mg/kg，较为接近，说明当十字花科类植物的饲喂量达到一定水平后，再提高饲喂量对生鲜乳中硫氰酸钠含量的提高帮助不大，推测可能是乳牛本身对硫代糖苷和生氰糖苷的吸收转化率有一定的极限。另外，在停止饲喂一个月后的空白对照组在试验过程中始终能检测到乳中硫氰酸钠含量在1～2 mg/kg，而且在体内消除实验的过程中也能检测到其始终维持在这一水平，说明饲喂十字花科类植物不是影响生鲜牛乳中硫氰酸钠含量的唯一因素。

通过体内消除试验可知，当乳中硫氰酸钠含量趋稳的饲喂组停止饲喂3 d后就能观察到其乳中硫氰酸钠含量的明显下降，但到5 d时会下降到达第一个平台期，推测可能与牛的反刍现象有关，其积存在瘤胃中的十字花科类植物通过反刍维持了其乳中硫氰酸钠的含量，而当达到9 d以后其乳中硫氰酸钠含量再次下降，直至达到与空白对照组相近的水平，验证了本市天然生鲜牛乳中硫氰酸钠含量的影响主要来自于十字花科类植物。

［1］顾 欣，黄士新，李丹妮，等.乳中硫氰酸盐对人类健康的风险评估［J］.中国兽药杂志，2010，44(9)：45-49.

［2］李 鲜，陈昆松，张明方，等.十字花科类植物中的硫代葡萄糖苷的研究进展［J］.园艺学报，2006，37(3)：15-17

［3］吴剑平，顾 欣，李丹妮，等.高效液相色谱法检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度［J］.中国乳品工业，2011，39(7)：44-46.

［4］吴剑平，顾 欣，李丹妮，等.毛细光电泳法检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度［J］.中国乳品工业，2012，40(3)：53-56.

［5］GB/T 4091-2001，常规控制图的理解与实施［S］.

［6］WHO.Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants［R］.Geneva，1990.

［7］Ponec C.Reports of Field Studies from Cuba and Other South-American and Centeral-American coutries Personaled at the Technical Meeting on the Benefits and Potential Risks of the LP-system of Raw milk Preservation［R］.Rome，2005.