葛根芩连汤对2型糖尿病大鼠肾脏的量效关系研究

★ 张金莲 张忠伟 王颖怡

（江西中医学院 南昌 330004）

葛根芩连汤出自张仲景所著的《伤寒论》，主治表证未解、邪热入里证，有清泄里热、解肌散邪之功。2型糖尿病是一种全球广泛流行的代谢性疾病，表现为体内胰岛素相对不足、靶细胞对胰岛素敏感性降低或患者产生的胰岛素本身存在结构上的缺陷。最终引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1]。实验研究证实，此方可明显降低正常小鼠及四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖，能减轻四氧嘧啶引起的氧自由基对胰岛β细胞的损害[2]。高晓村等[3]通过临床研究发现，葛根芩连汤合程氏萆薢分清饮加减汤剂能延缓湿热型病的进展，对糖尿病肾病有较可靠的疗效。本研究旨在探讨葛根芩连汤方剂量变化对2型糖尿病大鼠肾脏的治疗作用。现报告如下。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠258只，雄性，体重120-150g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号：HNASLKJ20101144。于室温，用标准大鼠饲养笼分笼喂养，自由饮水。普通大鼠饲料购于江西中医学院动物中心，高脂饲料是由上海斯莱克实验动物有限公司加工（批号20101013042）。

1.2 实验药品

葛根芩连汤组成：葛根8g、黄芩3g、黄连3g、炙甘草2g。实验用药由江西中医学院国家工程研究中心提供。盐酸二甲双胍：0.25g/片，批号：20100601、20101001，深圳海王药业有限公司。STZ（（streptozotoein，链脲佐菌素）：北京夏斯康特生物技术中心分装Sigma公司产品。

1.3 主要试剂

柠檬酸（核工业实验化工厂，分析纯）；柠檬酸三钠（核工业实验化工厂，分析纯）；DEPC（焦炭酸二乙脂）（北京索莱宝科技有限公司，高级纯）；氢氧化钠（天津市福晨化学试剂厂，分析纯，批号20060120）；氯化钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯，批号20100408）；葡萄糖（西陇化工股份有限公司，分析纯，批号：1005291）；EDTA-K2（乙二胺四乙酸二钾）（上海试剂一厂，分析纯，批号：20080904）；无水乙醇（上海振兴化工一厂，分析纯，批号：200909265和201104302）；乙醚（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20101206）；苦味酸（台山市化工厂有限公司，分析纯，批号：2009120）。

1.4 实验试剂盒和仪器

1.4.1 主要实验仪器 GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；SZ-97A自动三重纯水蒸流器（上海亚荣生化仪器厂）；TL-5.0W台式离心机（上海市离心机械研究所）；PHS-3C精密pH计（上海虹益仪器仪表有限公司）；EH5246电吹风（松下电工-万宝电器广州有限公司）；UV-3100PC紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；稳步型血糖仪（L6159RB01021）（强生（中国）医疗器械有限公司）；10mL注射器（型号100626）（江西三鑫医疗器械集团有限公司）；强生稳步型血糖试纸（批号：3075149008、3074021004）强生（中国）医疗器械有限公司；2.5mL注射器（型号100630）（江西三鑫医疗器械集团有限公司）；1mL注射器（型号100518）（江西三鑫医疗器械集团有限公司）；KQ-600DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；真空采血管（批号：091228）（江西省容和实业有限公司）；真空采血管（批号：100708）（江西省容和实业有限公司）。

1.4.2 试剂盒 血肌酐（Cr）（生产厂家：南京建成生物工程研究所，生产批号：20110621）；尿素氮（BUN）（生产厂家：南京建成生物工程研究所，生产批号：20110613）。

2 实验方法

2.1 适应性喂养

SPF级SD大鼠258只，于标准环境中适应性喂养1周。观察大鼠适应情况。

2.2 造模

适应性喂养1周后，分出正常组大鼠12只，除正常组给予普通饲料外，其余大鼠全部给予高脂饲料，自由饮水。高脂饲料喂养1个月，造模前所有大鼠禁食不禁水16小时，按30mg/kg的剂量给高脂饲料喂养的大鼠尾静脉注射链脲佐菌素溶液，正常组大鼠注射等体积柠檬酸缓冲液，注射2小时后，每只大鼠灌胃葡萄糖溶液4mL，并在平时饮水中酌情添加葡萄糖。注射后所有大鼠均喂食普通饲料，72小时后尾静脉取血，用血糖仪检测空腹血糖，再1周后同样方法检测血糖，两次血糖值均大于11.1mmol/L者，视为造模成功，共180只。将造模成功的大鼠按血糖值随机分为11个组，分别为模型组、阳性组（二甲双胍）、葛根芩连汤原方剂量组、葛根芩连汤3倍原方剂量组、葛根芩连汤5倍原方剂量组、葛根芩连汤7倍原方剂量组、葛根芩连汤9倍原方剂量组、葛根芩连汤11倍原方剂量组、葛根芩连汤13倍原方剂量组、葛根芩连汤15倍原方剂量组、葛根芩连汤17倍原方剂量组，再加正常组共分为12各组别。各组自由饮水，各组大鼠均喂食普通高压灭菌饲料，每天换大鼠垫料，并观察大鼠活动状态，毛色等，并记录死亡情况。

2.3 给予葛根芩连汤治疗

分组后，通过成人用量换算到大鼠给药量，给药组按体重灌胃葛根芩连汤，葛根芩连汤分别以1.65、4.95、8.25、11.55、14.85、18.15、21.45、24.75、28.05g饮片/kg给药，阳性药组灌胃200mg/kg/d的剂量的盐酸二甲双胍溶液，正常组和模型组给予相同体积的蒸馏水，连续给药至12周末。实验期间每周测体重1次，测血糖1次。给予充足的高压灭菌后的水及普通饲料，每天换垫料，每周清洗笼具及水瓶1次并高压灭菌。

2.4 动物处理

实验结束后，大鼠禁食12小时，不禁水，称量大鼠体重，乙醚麻醉，心尖取血，取血清，检测相应指标。每组大鼠取血后，取出肾脏并称重量。

2.5 检测指标及其方法

2.5.1 脏器指数 称取各大鼠的肾脏重量（g），脏器指数=脏器重量/大鼠体重×100%。

2.5.2 血清肌酐、尿素氮检测 血肌酐：检测方法：除蛋白法，按照试剂盒说明进行操作。尿素氮：检测方法：尿酶法，按照试剂盒说明进行操作。

2.6 统计学方法

使用spss17.0统计软件处理，实验数据以“均值±标准偏差”表示。采用单因素方差分析进行组间比较，以双侧P＜0.05或者P＜0.01为有统计学意义，量效关系曲线拟合由SPSS17.0统计软件完成。

表1 葛根芩连汤对糖尿病大鼠脏器指数、血肌酐、尿素氮的量效表（±s）

表1 葛根芩连汤对糖尿病大鼠脏器指数、血肌酐、尿素氮的量效表（±s）

注：与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05

组别正常组模型组二甲双胍组葛根芩连汤剂量/g•kg-1- -0.2 1.65 4.95 8.25 11.55 14.85 18.15 21.45 24.75 28.05 n 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8脏器指数(%)0.57±0.066 1.34±0.111#1.12±0.067*1.20±0.124*1.20±0.109*1.18±0.112*1.18±0.126*1.14±0.181*1.15±0.098*1.06±0.076*1.08±0.087*1.11±0.099*肌酐浓度(μmol/L)266.49±86.01 537.96±116.94#389.77±74.79*249.40±55.68*304.75±88.20*209.62±53.59*242.14±93.68*183.68±80.32*141.13±41.61*199.59±22.68*247.87±49.40*162.92±67.30*尿素氮浓度(mmol/L)6.90±0.83 17.08±2.46#15.43±1.00 14.19±1.60**15.96±3.13 15.44±1.30 14.25±2.14**12.94±2.48*12.47±2.59*12.03±1.18*11.10±2.15*13.39±1.44*

3 结果

3.1 脏器指数及血肌酐、尿素氮水平数据表

3.2 数据拟合后的量效关系曲线

3.2.1 肾脏脏器指数量效关系曲线

图1 葛根芩连汤与肾脏脏器指数量效关系

由方程式和图1分析，表明葛根芩连汤给药剂量在1.65g饮片/kg-28.05g饮片/kg之间时，随着剂量的增大，脏器指数减小（效应增强）。

3.2.2 血肌酐和尿素氮

图2 葛根芩连汤与血肌酐含量的量效关系

由方程式和图2分析，表明随着葛根芩连汤给药剂量的增大，血肌酐含量降低（效应增强）。

图3 葛根芩连汤与血尿素氮含量的量效关系

由曲线方程式与图3分析，表明葛根芩连汤在1.65g饮片/kg-28.05g饮片/kg剂量之间，趋势为随着剂量的增大，血尿素氮含量降低（效应增强）。

4 讨论

现代医药学已经证明，葛根芩连汤方中各药均有不同程度的降糖和（或）改善糖尿病慢性并发症的药理作用。赵林华等[4]取葛根芩连汤清热化湿、生津润燥的功效，用于糖尿病湿热证及其并发症的治疗，降糖作用明显，疗效肯定。曾艺鹏等[5]发现对伴有湿热证的2型糖尿病患者，在短期胰岛素强化治疗的基础上，联合葛根芩连汤加味治疗，可以相对减少胰岛素用量，并取得较好的临床疗效。提示葛根芩连汤在改善糖尿病患者湿热证的过程中，对减轻2型糖尿病患者胰岛素抵抗，促进胰腺β细胞的功能恢复上有帮助。

大鼠的脏器指数是指大鼠的脏器重量与大鼠体重的比值。可以较为客观的指示脏器的病变状态。本实验结果表明葛根芩连汤可以较为明显的降低肾脏脏器指数，其中在14.85g饮片/kg-21.45 g饮片/kg剂量之间对肝脏脏器指数的下降有明显的量效关系；在4.95g饮片/kg-21.45g饮片/kg剂量之间对于肾脏的脏器指数改善有明显的量效关系。

血肌酐是人体肌肉代谢的产物，肌酐主要通过不可逆的非酶脱水反应缓慢地生成肌酐，再释放到血液中随尿液排泄掉，因此血肌酐与人体的肌肉总量关系密切，基本上不受饮食，分解代谢等肾外因素的影响，在外源性肌酐摄入量稳定及体内生成量恒定的情况下，血肌酐的浓度主要取决于肾小球滤过功能的影响。血尿素氮是人体蛋白质代谢的产物，尿素氮的含量与肾小球的滤过功能也有较大的关系。

临床上2型糖尿病患者的并发症较多，如糖尿病肾病、糖尿病足病、糖尿病脑病等。血清尿素氮和血肌酐的含量是肾功能较为主要的两个指标，具有重要参考意义。本实验经过初步研究，表明葛根芩连汤可以较为明显的降低血清肌酐和尿素氮的含量。在4.95g饮片/kg-21.45 g饮片/kg剂量之间对于血肌酐含量下降有明显的量效关系，经过曲线拟合表明葛根芩连汤方剂量变化与血肌酐含量呈现负相关性，即剂量增加，效应增强。经过曲线拟合表明葛根芩连汤方剂量变化与血尿素氮的含量呈现多波折的量效关系，葛根芩连汤在8.25g饮片/kg-21.45g饮片/kg剂量之间，趋势为随着剂量的增大，效应增强。提示葛根芩连汤对糖尿病肾病的改善有一定的帮助作用。

通过对血尿素氮等指标进行数据拟合得到最佳剂量范围大致处于18.15g饮片/kg-24.15g饮片/kg，对应于原方相当于1两=13g-15g之间，这个研究结果与目前大多数学者关于经方用药中“两”的量值认识情况较吻合。

[1]朱禧星，杨永年，沈稚舟.现代糖尿病学[M].上海：上海医科大学出版社，2000.

[2]潘竞铿，韩超，刘惠纯.葛根芩连汤降血糖作用的实验研究[J].中国新药杂志，2000，9（3）：167.

[3]高晓村.葛根芩连汤合程氏萆薢分清饮加减治疗湿热型糖尿病肾病的疗效观察[J].北京中医药，2009，28（9）：718-719.

[4]赵林华，仝小林，连凤梅，等.经方葛根芩连汤治疗糖尿病及其并发症初探[C].第四届国际中医糖尿病大会论文汇编，2009：352.

[5]曾艺鹏，黄云胜，胡蕴刚，等.葛根芩连汤配合胰岛素强化治疗湿热证2型糖尿病临床观察[J].中国中西医结合杂志，2006，26（6）：514.