丹参酮ⅡA脂微球注射液制备工艺研究*

★ 曹运朝 梁新丽廖正根 赵国巍 招丽君 倪斌（江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室南昌 330004）

丹参为中国的传统中药，最早见于《神农本草经》，并被列为上品。Tan-ⅡA是从传统的活血化淤类中药丹参中提取的脂溶性有效成分，具有抗氧化、降低自由基水平、保护血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化形成、预防心绞痛与心肌梗塞及抗癌[1]，尤以治疗冠心病及缺血性脑血管病最为常用[2]。由于Tan-ⅡA为脂溶性成分，无法直接注射给药，乳剂[3]作为一种优良的载体，可包载脂溶性药物，轻易通过血脑屏障（BBB），达到治疗脑部疾病的效果。本研究采用高速剪切法制备初乳，以Ke为考察指标，单因素筛选初乳的制备工艺；采用高压均质机对初乳进行二次乳化，以Ke、平均粒径、载药量为考察指标，正交设计优化Tan-ⅡA脂微球高压均质的制备工艺。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；UV 2100 PC型紫外分光光度计（尤尼科上海仪器有限责任公司）；TG328A十万分之一电子天平（德国Startorius公司）；Malvern纳米粒度仪（英国马尔文公司）；乳化机（FA25 model上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；HF6A型多头磁力加热搅拌器（常州国华电器有限公司）；高压均质机（加拿大ATS公司）。

1.2 材料 注射用大豆油（LCT铁岭北亚药用油有限公司，批号y11030103-2-01）；注射用中链脂肪酸甘油脂（MCT Lipoid，批号940031）；蛋黄卵磷脂（Lipoid E80，批号；20100021）；注射用油酸钠（Lipoid sodium oleate B，批号204352-1）；注射用Tween-80（上海申宇医药化工有限公司）；注射用甘油（江西益谱生药业有限公司，批号20100601）；泊洛沙姆F-68（珠海远城医药化工公司）；Tan-ⅡA原料（西安昊轩生物有限公司，含量≥98%，批号DST-110105）；正辛醇（上海化学试剂公司）；甲醇（色谱纯，德国Merk），水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 丹参酮ⅡA脂微球的评价方法

2.1 Tan-ⅡA含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex-C18，（4.6×150mm，5 μm）；流动相为甲醇：水=80：20；流速：1.0mL/分；检测波长：270nm；柱温：25℃ ；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，Tan-ⅡA对照品（A），空白脂微球（B），Tan-ⅡA脂微球（C）三色谱无干扰，见图1。

图1 Tan-ⅡA高效液相色谱图

2.1.2 标准曲线的制备

精密称取Tan-ⅡA对照品2.0mg，加甲醇定容至50mL的容量瓶中，得Tan-ⅡA浓度为44.8μg/mL的储备液。精密量取Tan-ⅡA储备液3mL置10mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，即得Tan-ⅡA浓度为13.44μg/mL，分别精密吸取13.44μg/mLTan-ⅡA对照品0.5、1、2、3、4、5、6mL加甲醇定容至10mL，配制成Tan-ⅡA对照品浓度分别为0.732 μg/mL、1.344μg/mL、2.688μg/mL、4.032μg/mL、5.376μg/mL、6.72μg/mL、8.064μg/mL的系列溶液。按“2.1.1”项下液相色谱条件，各对照品溶液分别进样20 μL，测定峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，溶液浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程如下：A=121.46C-1.4275，r=0.9998，线 性 范 围 为 0.732～8.064μg/mL。

2.1.3 精密度实验

分别用3种浓度的Tan-ⅡA供试品溶液（0.732、4.032、8.064μg/mL），在上述色谱条件下进样20μL，1天内重复进样5次，连续进样5天，记录Tan-ⅡA的峰面积。结果日内RSD分别为1.310%、0.374%和1.061%（n=5）日间RSD分别为2.192%、1.493%和1.1828（n=5），表明方法精密度良好。

2.1.4 回收率实验

取浓度分别为（0.732、4.032、8.064μg/mL）Tan-ⅡA供试品溶液各5份，在上述色谱条件下进样，每次进样20 μL，测定Tan-ⅡA的峰面积，根据标准曲线计算Tan-ⅡA的浓度，以测定浓度与配制浓度之比计算回收率。高、中、低3个浓度的回收率为95.78%-105.7%，RSD为2.34%-4.43%。

2.2 离心稳定性

乳剂的物理稳定性变化表现为分层、析油等现象。将乳剂在一定转速下离心一段时间，对乳剂的影响相当于自然静置较长时间产生的影响，因此用离心分光光度法测得的稳定性常数Ke可作为评价乳剂物理稳定性的一个指标[4]。方法：将初乳剂2mL置于离心管中以1000r/分离心3分钟，终乳以3000r/分离心10分钟，用微量进样器精密量取试管底部110uL至100mL容量瓶中，用过0.22μm微孔滤膜的蒸馏水稀释定容，以蒸馏水为空白，用紫外-可见分光光度计在可见区500nm处测定吸收度n（=3），记为A。同法将未离心的乳剂在相同波长下测定吸收度（n=3），记为Ao。按以下方法计算乳剂稳定性参数Ke：

公式中Ke为乳剂的稳定性常数。Ke值越小，说明分散的乳滴在离心力的作用下上浮的越少，表示此乳剂越稳定，故可以用Ke值来评价乳剂的物理稳定性。

2.3 乳剂粒径及粒径分布

制备粒径小而均匀的分散系，是体系物理稳定性良好的基本保证[5]。取Tan-ⅡA脂微球溶液适量，以双蒸水稀释200倍后，用纳米粒度分析仪测定纳米粒的平均粒径及粒径分布。

3 内容和结果

3.1 单因素考察丹参酮ⅡA脂微球初乳的制备工艺

参照丹参酮磺酸钠注射液的临床使用剂量40-80mg/次/日。参照参考文献，规定本品的规格为0.7mg/mL。在实验的基础上，将本品的基本处方暂定为：LCT：MCT=1：1 20g，磷脂 1g，F-68 0.4g，Tween-80 0.2g，甘油2.25g，油酸钠0.03g，注射用水加至100mL。

3.1.1 初乳两相混合顺序的筛选

固定如下因素水平：制备温度70℃，搅拌速度10 000r/分，搅拌时间10分钟。以Ke为考察指标，考察两相混合方式和混合顺序对Ke的影响。

称取处方量的混合油相，70℃加入1g卵磷脂并充分搅拌使其全部溶解，然后加入70mgⅡA使其彻底溶解，即得油相；同时在水相中加入处方量的F-68、Tween-80、甘油、油酸钠 ，使其充分溶解，70℃保温即得水相。称取工艺一：油相恒速缓慢加入到搅拌中的全部水相中，搅拌10分钟。工艺二：恒速缓慢将油相加入到70%的水相中，剩余的30%的水相70℃恒温，待初乳制备完成后再加入剩余的30%的水，考察制备中相比变化的影响。工艺三：将油相一次性加入水相中，然后再高速搅拌，与恒速缓慢加入相比较。工艺四：先将油相先加入搅拌器中，然后缓慢加入水相。工艺五：将70%的水相恒速缓慢加入搅拌中的油相中，待初乳成型后再加入剩余量的水相稀释。按离心法评价工艺优越。初乳制备结果见图2。

图2 油水两相不同的加入顺序和相比变化对Ke的影响

结果：工艺1和工艺4较好，但工艺1和4没显著性差异。考虑在实际操作中水相比较多，油相较少，工艺4操作不便，故选择工艺1。

3.1.2 搅拌速度和时间的选择

按上述优化工艺，改变转速和时间，考察机械力度对离心稳定性常数的影响。在参考文献的基础上[6]，先固定搅拌时间为10分钟，考察搅拌速度对乳剂Ke的影响，结果见图3。结果表明搅拌速度为13 000r/分稳定性较好；根据优化的工艺，固定搅拌速度，考察搅拌时间对乳剂Ke影响，结果见图4，结果表明搅拌时间10、12、14分钟对Ke影响不大，考虑到节约时间，故选择10分钟。

图3 不同搅拌速度对Ke的影响

表4 不同搅拌时间对Ke的影响

3.2 正交设计优化高压均质工艺

以Tan-ⅡA脂微球的Ke、平均粒径、载药量为考察指标，选择均质压力（A）、均质次数（B）及初乳制备温度（C）作为考察因素[7]，每个因素又设定三个水平，根据因素水平表，选择正交表L9[4]进行实验。为在统一标准下加权评分[8]，三项指标最佳的分别定为30、30和40分，规定离心稳定性常数最小的即3.9为30分，其余各值以公式：30-（离心稳定性常数-3.9）×2计分；规定粒径最小的即273nm为30分，其余各值以公式：30-（粒径-273）计分；规定载药量最大的即692μg为40分，其余各值以公式：40-（692-载药量）/10计分；最后将三个指标的分值之和作为该试验的分值，并进行方差分析，结果见表1、2。

表1 高压均质工艺正交实验设计结果

表2 Tan-ⅡA脂微球工艺考察方差分析表

以综合评分为考察指标，由表1、2可知因素A与C对试验影响显著，因素B对试验结果影响不明显。对于Tan-ⅡA脂微球较优的高压均质工艺为A2B1C3即80℃，70Mpa，高压均质8次。

3.3 Tan-ⅡA脂微球制备工艺的验证

称取处方量的混合油相，80℃加入1g卵磷脂并充分搅拌使其全部溶解，然后加入70mgⅡA使其彻底溶解，即得油相；同时在水相中加入处方量的F-68、Tween-80、甘油、油酸钠，使其充分溶解，80℃保温即得水相。油相恒速缓慢加入到搅拌中的全部水相中，13 000r/分剪切10分钟，即得初乳，初乳经高压均质机70Mpa，均质8次。测定脂微球Ke、粒径、载药量，数据见表3。

表3 工艺验证数据

从重复实验数据可得，用单因素及正交优选的Tan-ⅡA脂微球制备工艺较为稳定、重复性好。

4 讨论

丹参酮ⅡA几乎不溶于水，实验测得丹参酮ⅡA在水中的溶解度小于5 μg/mL。文中将丹参酮ⅡA制成微乳后，其含量大于700 μg/mL，较为显著地提高了丹参酮ⅡA的溶解度。

脂微球的基本制备工艺为“初乳制备”，再“高压均质”，使脂肪乳的粒径一般控制在300 nm左右。本文以稳定性常数Ke为指标，研究了初乳的制备温度、高速剪切的转数、剪切时间对初乳稳定性的影响，筛选了初乳的制备工艺。进一步采用正交设计，优化初乳的二步高压均质机匀化工艺，考察了高压均质压力、均质次数等工艺因素对乳剂稳定性、粒径、载药量的影响，确定了丹参酮ⅡA脂微球的高压均质工艺。

采用本实验结果对丹参酮ⅡA脂微球工艺进行验证，结果表明用单因素及正交优选的Tan-ⅡA脂微球制备工艺较为稳定、重复性好。

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