罗格列酮对急性坏死性胰腺炎及其肺损伤保护作用的实验研究

蔡笃雄 陈卫昌 曾仕平 汤净

罗格列酮对急性坏死性胰腺炎及其肺损伤保护作用的实验研究

蔡笃雄 陈卫昌 曾仕平 汤净

重症急性胰腺炎(series acute pancreatitis,SAP)是临床上常见的危重疾病，病情进展迅速，病死率高。因此，早期对SAP发病机制中的相关因素进行干预可能成为治疗SAP的重要措施。

本研究应用过氧化物酶增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARγ)激动剂罗格列酮干预急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠，探讨罗格列酮对ANP及其肺损伤的保护作用。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：健康SD大鼠72只，体重200～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(SCXK湘2009-0004)。按完全随机法分为ANP组、罗格列酮组(干预组)及假手术组，每组24只。采用胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠0.1 ml/100 g体重(Sigma公司)方法建立ANP模型，罗格列酮组于制模前30 min腹腔内注射罗格列酮10 mg/kg体重(天津葛兰素史克公司)。假手术组开腹后仅翻动胰腺即关腹。分别于术后3、6、12 h腹主动脉抽血后处死大鼠，留取胰腺及肺组织。

2．血淀粉酶、TNF-α、IL-6、氧分压(PaO2)检测：血浆淀粉酶采用全自动生化分析仪检测；PaO2采用血气分析仪检测；血浆TNF-α、IL-6采用ELISA法检测，试剂盒购自北京晶美生物工程公司，按说明书操作。

3．胰腺及肺组织病理检查：按常规操作。

4．胰腺组织PPARγ mRNA和热休克蛋白70(HSP-70)mRNA及肺组织TNF-α、黏附分子1(ICAM-1) mRNA表达检测：采用RT-PCR法。PPARγ正义5′-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3′，反义5′-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3′，产物335 bp；HSP-70正义5′-GCTGACCAAGATGAAGGAGATC-3′，反义5′-GAGTCG-ATCTCCAGGCTGGC-3′，产物645 bp；TNF-α正义 5′-CTCAAAGACAACCAACTGGTGGTAC-3′，反义 5′-ACAGAGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′，产物312 bp；ICAM-1正义5′-ACCACAGCTGACAGGGAAATCG-3′，反义5′-AGAGGTCTTTACGCATGTCAACG-3′，产物282 bp。以β-actin(221 bp)为内参。引物由上海生工生物工程公司合成。反应条件： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s或1 min，50℃(PPARγ)或55℃(ICAM-1)或58℃(HSP-70)或60℃(TNF-α) 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃7 min，4℃放置。产物电泳分离后扫描，以目的条带与β-actin的灰度比值表示mRNA的相对表达量。

二、结果

1．血淀粉酶、TNF-α、IL-6、PaO2水平的变化：ANP组血淀粉酶、TNF-α、IL-6及PaO2水平较假手术组同时间点均显著升高(P<0.05或<0.01)；干预组淀粉酶、TNF-α及IL-6水平均较ANP组同时间点明显降低(P<0.05或<0.01)，6、12 h点的PaO2较ANP组明显升高(P<0.05，表1)。

2．胰腺及肺组织病理改变：假手术组胰腺及肺组织无明显病理改变。ANP组3 h时胰腺腺泡水肿，炎症细胞浸润明显，可见局灶性腺泡细胞变性坏死，随着时间的延长，病变呈进行性加重；干预组胰腺水肿、出血及炎症细胞浸润均较ANP组减轻。ANP组3 h时肺泡壁水肿，肺间质中性粒细胞及单核细胞浸润，随着时间的延长，病变逐渐加重；干预组肺泡壁、肺间质水肿及炎症细胞浸润均较ANP组明显减轻(图1)。

3．胰腺组织PPARγ、HSP-70 mRNA表达：干预组胰腺PPARγ、HSP-70 mRNA表达较假手术组及ANP组均显著增强(P<0.05或<0.01)，而假手术组和ANP组间PPARγ mRNA表达无显著差异。ANP组6、12 h点胰腺HSP-70 mRNA表达较假手术组明显增加(P值均<0.05，图2，表2)。

组别 时间(h)只数淀粉酶(U/L)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)PaO2(mmHg)假手术组381434±58.58±94.21±93.5±123 14.9014.272.4681641±63.19±92.19±92.4±683 16.6811.483.91281604±58.21±99.64±91.0±457 15.4018.236.5ANP组 384160±83.32±121.81±85.1±618b18.22a14.94b5.5b685194±106.49±132.49±77.9±1603b 29.13b23.76b6.0b1285875±96.38±146.01±68.6±1149b 20.98b18.61b7.4b干预组 383392±64.68±106.98±89.5±410bd19.46c11.24c5.0683585±83.64±110.71±85.4±1893c 15.96c17.52c7.1ac1284517±70.43±123.58±79.6±1493c 21.30c18.13ac11.7ac

注：与假手术组同时点比较，aP<0.05，bP<0.01与ANP组同时点比较，cP<0.05,dP<0.01。1 mm Hg=0.133 kPa

图1对照组(a)、ANP组(b)、干预组(c)大鼠12 h时胰腺(上)和肺(下)组织的病理改变(HE ×100)

1：对照组；2：ANP组；3：干预组

4．肺组织TNF-α、ICAM-1 mRNA表达：假手术组肺组织TNF-α mRNA及ICAM-1 mRNA均呈微弱表达，ANP组的表达较假手术组明显增加(P<0.01)，干预组又较ANP组显著降低(P<0.05，表2，图3)。

组别时点(h)只数PPARγmRNAHSP-70mRNATNF-αmRNAICAM-1mRNA对照组380.35±0.42±0.28±0.22±0.060.120.720.43680.37±0.44±0.30±0.24±0.090.110.590.621280.39±0.46±0.27±0.23±0.080.080.560.68ANP组380.33±0.45±0.51±0.44±0.100.110.66b0.50b680.35±0.58±0.94±0.85±0.560.12a0.91b0.47b1280.37±0.62±0.73±0.92±0.090.12a0.76b0.10b干预组380.47±0.61±0.43±0.39±0.13ac0.12bc0.58bc0.49bc680.65±0.73±0.81±0.76±0.13bd0.13bc0.12bc0.93bc1280.71±0.80±0.64±0.81±0.09bd0.15bc0.82bc0.13bc

注：与对照组同时点比较，aP<0.05，bP<0.01；与ANP组同时点比较，cP<0.05,dP<0.01

1：对照3 h组；2：ANP 3 h组；3：干预3 h组；4：ANP 6 h组；5：干预6 h组；6：ANP 12 h组；7：干预12 h组

图3各组大鼠肺组织TNF-α mRNA(a)及 ICAM-1 mRNA(b)的表达

讨论PPARγ是一个细胞增殖和炎症反应的调节剂，可调节炎症相关基因的表达，包括抑制IL-1、TNF-α、IL-6的产生及ICAM-1、NF-κB的表达等。Ivashchenko等[1]的研究发现，罗格列酮通过激活PPARγ而改善大鼠急性水肿型胰腺炎的病情。Rollins等[2]研究结果表明，雨蛙素可降低胰腺PPARγ的表达，使用PPARγ激动剂干预后，能恢复胰腺PPARγ的表达水平,PPARγ的表达与胰腺炎的严重程度和致炎细胞因子IL-6、TNF-α呈负相关。孙俊涛等[3]研究表明，罗格列酮通过激活PPARγ而减轻AP小鼠肝损伤。本研究结果显示，罗格列酮处理后ANP大鼠胰腺PPARγ mRNA表达水平显著增强，胰腺损伤减轻，与文献结果一致。

HSP是指细胞在多种应激原，特别是高温环境下被应激诱导合成的一组蛋白质，目前的研究主要集中在HSP70和HSP20。Grisé等[4]研究发现，高热预刺激可诱导胰腺HSP-70表达，降低AP小鼠血清TNF-α、IL-6水平，减轻胰腺损伤，降低死亡率。Konturek等[5]用雨蛙素诱导大鼠AP模型，应用吡格列酮干预后，胰腺组织炎症和损伤减轻。本研究中，罗格列酮组胰腺HSP-70 mRNA表达水平较ANP和假手术组显著增加，提示罗格列酮也可能通过诱导HSP-70 mRNA的表达减轻胰腺的病理损伤。

细胞因子TNF-α、IL-6及ICAM-1在ANP及其肺损伤的发病机制中具有重要的作用。Cuzzocrea等[6]研究发现，罗格列酮通过减少细胞因子及炎症介质的产生从而改善大鼠急性水肿型胰腺炎的病情。本研究中，罗格列酮组血浆TNF-α、IL-6水平较ANP组显著降低，从而发挥抗炎症效应。此外，罗格列酮组肺组织TNF-α、ICAM-1 mRNA表达水平较ANP组显著降低，肺组织病理损伤明显减轻，动脉PaO2升高，提示罗格列酮可能通过减少肺组织TNF-α及ICAM-1的产生从而减轻ANP合并的肺损伤程度。

[1] Ivashchenko CY,Duan SZ,Usher MG, et al.PPAR-gamma knockout in pancreatic epithelial cells abolishes the inhibitory effect of rosiglitazone on caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293:G319-G326.

[2] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflam matory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130．

[3] 孙俊涛，许刚，田克立.PPARγ激动剂对急性胰腺炎小鼠肝损伤的影响.中华胰腺病学杂志,2010,10:138-139.

[4] Grisé K,Kim F,McFadden D.Hyperthermia induces heat-Shock protein expression, reduces pancreatic injury, and improves survival in necrotizing pancreatitis.Pancreas, 2000,21:120-125.

[5] Konturek PC,Dembinski A,Warzecha Z,et al.Pioglitazone，a specific ligand of peroxisome proliferator-activated receptorgamma，protects pancreas against acute cerulein-induced pancreatitis.World J Gastroenterol,2005,11:6322-6329.

[6] Cuzzocrea S,Pisano B,Dugo L,et al.Rosiglitazone,a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,reduces acute pancreatitis induced by cemlein.Intensive Care Med,2004,30:951-956.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.020

海南省自然科学基金资助(807093)

570102 海口，海南医学院附属医院消化内科(蔡笃雄、曾仕平、汤净)；苏州大学附属第一医院消化内科(陈卫昌)

陈卫昌，Email:weichangchen@126.com

2011-11-28)

(本文编辑：吕芳萍)