半乳凝素3在胰腺癌细胞中的表达及对胰腺癌SW1990细胞增殖和侵袭的影响

周国雄 张淼 丁晓凌 张海峰 曹维 瞿利帅 蒯小玲 张弘 徐正府

·论著·

半乳凝素3在胰腺癌细胞中的表达及对胰腺癌SW1990细胞增殖和侵袭的影响

周国雄 张淼 丁晓凌 张海峰 曹维 瞿利帅 蒯小玲 张弘 徐正府

目的研究半乳凝素3(galectin-3)在胰腺癌细胞株中的表达及对人胰腺癌细胞株SW1990增殖和侵袭能力的影响。方法采用免疫细胞化学法和RT-PCR方法检测胰腺癌细胞株SW1990、PANC1、AsPC-1的galectin-3蛋白和mRNA表达。分别应用1、2、3、5 μg/ml galectin-3单抗处理SW1990细胞24、48、72 h，采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖，Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果胰腺癌SW1990、PANC1、AsPC-1细胞均有galectin-3 mRNA和蛋白表达。galectin-3单抗呈浓度和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖及穿膜细胞数。培养72 h时2、3、5 μg/ml galectin-3单抗的细胞生长抑制率分别为19.8%、29.9%和42.7%，与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。3 μg/ml galectin-3单抗组的穿膜细胞抑制率为37.1%，与对照组的10.4%差异有统计学意义(P<0.05)。结论galectin-3在胰腺癌细胞中高表达，用抗体中和galectin-3能抑制SW1990细胞的增殖和侵袭能力。

胰腺肿瘤； 半乳糖凝集素3； 细胞增殖； 肿瘤浸润

半乳凝素(galectin)是动物凝集素家族中的一员，有多种生物学功能。到目前为止，已识别的哺乳动物半乳凝素家族有15个成员。Galectin-3是其中之一，它广泛表达于正常组织和肿瘤组织中，参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、细胞黏附及新生血管形成和肿瘤浸润与转移等[1]。目前关于galectin-3在胰腺癌中作用的研究报道比较少。本研究检测胰腺癌细胞株galectin-3的表达，观察其在细胞增殖、侵袭中的作用。

材料与方法

一、细胞培养

胰腺癌细胞株SW1990、PANC1、AsPC-1购自中国科学院上海生命科学研究院，常规培养，待细胞单层贴壁生长至80%左右时用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3比例传代接种至新的培养瓶中继续培养。

二、Galectin-3蛋白检测

采用常规免疫细胞化学方法。鼠抗人galectin-3单克隆抗体(美国R&D公司)工作浓度1∶100，用TBS代替一抗作为阴性对照。

三、Galectin-3 mRNA检测

采用RT-PCR方法。应用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取胰腺组织总RNA，根据Genbank中基因序列自行设计引物，由invitrogen(上海)公司合成。galectin-3引物序列为5′-GGCCACTGATTGTGCCTTAT-3′和5′-CAAATGGGAAAACCGACTGT-3′，产物243 bp；内参β-actin引物序列为5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′和5′-ATGCATTCACCTCCCCTGTG-3′，产物486 bp。PCR反应参数：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 40 s、72℃ 40 s，30次循环，72℃ 10 min。PCR产物经电泳分离后用图像扫描仪测定光吸收值，以目的条带与β-actin条带的光吸收值比为mRNA相对表达量。

四、细胞增殖检测

采用CCK-8法。收集对数生长期的胰腺癌SW1990细胞，调整细胞密度为5×104ml,接种于96孔培养板，每孔100 μl。待细胞贴壁后分为对照组，galectin-3单抗1、2、3、5 μg/ml组及空白组，各设5个复孔，培养液均无血清。常规培养24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，继续培养24、48、72 h。用空白组调零，酶标仪测定各时间点各孔A450值。增殖抑制率=(1-实验组A450值/对照组A450值)×100%。

五、 细胞侵袭实验

在冰上将Matrigel胶与无血清的4℃预冷细胞培养基DMEM按1∶8稀释，加入transwell上室，每室100 μl。37℃孵育5 h后用无血清培养基轻洗上室凝胶，再37℃孵育30 min。用无血清培养基重悬细胞，细胞密度为5×105/ml 。上室加200 μl含0(对照)、1、2、3 μg/ml galectin-3抗体的细胞悬液，下室加600 μl含5%胎牛血清的DMEM培养基，每组3个小室，继续培养24 h。用0.1%结晶紫染色30 min，计算各小室的穿膜细胞数。细胞侵袭抑制率 =[(对照组穿膜细胞数-加抗体组穿膜细胞数)/对照组穿膜细胞数]×100%。

六、统计学处理

结 果

一、SW1990、PANC1、AsPC-1细胞的galectin-3蛋白及mRNA表达

胰腺癌SW1990、PANC1、AsPC-1细胞均有galectin-3蛋白及mRNA表达(图1、2)。

图1SW1990(a)、PANC1(b)、AsPC-1(c)细胞的galectin-3蛋白表达(×200)

1、4：SW1990；2、5：PANC1；3、6：AsPC-1

二、Galectin-3单抗对SW1990细胞生长的影响

不同浓度galectin-3单抗处理后，SW1990细胞生长呈浓度和时间依赖性被抑制(表1)。培养24 h时2 μg/ml galectin单抗的细胞生长抑制率为27.0%；培养48 h时3、5 μg/ml galectin单抗的细胞生长抑制率分别为22.0%和35.1%；培养72 h时2、3、5 μg/ml galectin单抗的细胞生长抑制率分别为19.8%、29.9%和42.7%，与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

三、Galectin-3对SW1990细胞侵袭能力的影响

Galectin-3单抗呈浓度依赖性抑制穿膜细胞数(图3)，1、2、3 μg/ml galectin-3单抗的抑制率分别为10.4%、11.6%、37.1%。

组别24h48h72h对照组0.403±0.0140.502±0.0050.600±0.0031μg/ml组0.383±0.0160.488±0.0140.582±0.0192μg/ml组0.371±0.0270.476±0.0170.561±0.009a3μg/ml组0.362±0.0400.469±0.028a0.544±0.006a5μg/ml组0.348±0.015a0.449±0.006a0.515±0.009a

注：与对照组比较，aP<0.05

图3对照组(a)及1(b)、2(c)、3(d)μg/ml galectin-3单抗组的穿膜细胞(×100)

讨 论

Galectin-3在多数肿瘤中呈高表达，发挥着多种生物学作用，包括调节细胞的生长、凋亡、细胞黏附、参与新生血管形成及肿瘤浸润与转移等。Kawachi等[2]研究发现,在甲状腺癌组织中galectin-3呈高表达，且晚期甲状腺癌的表达量更高，而甲状腺正常组织、癌旁组织及甲状腺腺瘤中galectin-3无表达或极弱表达。然而Idikio[3]研究发现，乳腺癌组织galectin-3的表达较正常乳腺组织下调，表明galectin-3在不同肿瘤中的表达是不一样的。本研究证实，胰腺癌SW1990、PANC1、AsPC-1细胞均有galectin-3 mRNA和蛋白表达，提示galectin-3可能在胰腺癌的发生、发展中具有重要作用。

Lin等[4]在乳腺癌细胞体外实验研究时发现，galectin-3下调cyclin E和cyclin A表达，上调细胞周期抑制蛋白p21和p27的表达，同时还活化细胞周期D1启动子，进而调节细胞的生长。进一步研究表明，galectin-3通过结合胞内β-连环蛋白(catenin)，活化cyclin D1而调节细胞周期[5]。另有研究小组观察到转染了编码galectin-3的cDNA的肿瘤细胞在促凋亡因子的作用下，使galectin-3从胞质或胞核中移位到线粒体膜上，稳定线粒体膜电位，抑制细胞色素C的释放，保护线粒体免受损伤，进而抑制细胞凋亡，促进细胞的增殖[6]。本实验结果显示， galectin-3单抗呈浓度和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖，验证了galectin-3对胰腺癌细胞株SW1990的促增殖作用。

本实验结果还显示，galectin-3单抗呈浓度依赖性抑制胰腺癌SW1990的侵袭能力，提示galectin-3促进细胞的侵袭。其机制主要是：(1)上调整合素的表达量，促进肿瘤细胞与基质的黏附[7]， 促进肿瘤细胞的侵袭；(2)直接与整合素 β亚基 以凝集素-糖化合物相结合，促进肿瘤细胞与基质的黏附[8]；(3)与细胞表面CD98结合后促使整合素在细胞表面聚集成簇，间接增强整合素与其配体的亲和力，增加肿瘤细胞与细胞外基质的黏附；(4)直接结合糖基化的细胞外基质成分，包括成黏连蛋白、纤维蛋白、黏蛋白和Mac-2 结合蛋白等。

[1] Woo HJ, Joo HG, Song SW, et al. Immunohistochemical detection of galectin-3 in canine gastric carcinomas. J Comp Pathol, 2001, 124:216-218.

[2] Kawachi K, Matsushita Y, Yonezawa S,et al. Galectin-3 expression in various thyroid neoplasms and its possible role in metastasis formation. Hum Pathol, 2000,31:428-433.

[3] Idikio H. Galectin-3 expression in human breast carcinoma: correlation with cancer histologic grade. Int J Oncol, 1998,12:1287-1290.

[4] Lin HM, Pestell RG, Raz A,et al. Galectin-3 enhances cyclin D1 promoter activity through SP1 and a cAMP-responsive element in human breast epithelial cells. Oncogene，2002，21：8001-8010.

[5] Shimura T, Takenaka Y, Tsutsumi S, et al. Galectin-3: a novel binding partner of beta-catenin. Cancer Res, 2004, 64:6363-6367.

[6] Lju FT, Patterson RJ, Wang JL. Intracell ular functions of galectins. Biochim Biophys Acta, 2002, 1572:263-273.

[7] Parise LV, Lee J, Juliano RL. New aspects of integrin signaling in cancer. Semin Cancer Biol, 2000,10:407-414.

[8] Hughes RC. Galectins as mod ulators of cell adhesion. Biochimie,2001, 83:667- 676.

Expressionofgalectin3anditseffectsonproliferationandinvasioninpancreaticcancerSW1990cells

ZHOUGuo-xiong,ZHANGMiao,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,CAOWei,JULi-shuai,KUAIXiao-ling,ZHANGHong,XUZheng-Fu.

DepartmentofGastroeterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,ChinaCorrespondingauthor：ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

ObjectiveTo investigate the expression of galectin-3 in pancreatic cancer cell and its effect on the proliferation and invasion of SW1990.MethodsImmunocytochemistry and semi-quantitative RT-PCR was used to detect the expression of galectin-3 protein and mRNA in SW1990, PANC1 and ASPC-1 cell lines. Galectin-3 mono-antibody of different concentrations (1, 2, 3, 5 μg/ml) was used to treat SW1990 cells for 24, 48, 72 h, CCK-8 kits were used to detect the proliferation in SW1990 cells; Transwell chamber was used to study the invasion in SW1990.ResultsExpression of galectin-3 protein and mRNA was present in SW1990, PANC1, and ASPC-1. Galectin 3 mono-antibody inhibited the proliferation and number of invasive cells in a dose and time dependant manner. The inhibitory rates at 72 h were 19.8%, 29.9% and 42.7% in 2, 3, 5 μg/ml galectin 3 mono-antibody groups, the difference among them and control group was statistically significant (P<0.05). The inhibite rate of permeating membrane cells in 3 μg/ml galectin-3 mono antibody was 37.1%, the difference between this group and control group was statistically significant (P<0.05).ConclusionsGalectin-3 is highly expressed in pancreatic cancer cells. Galectin-3 antibody can inhibit the proliferation and migration capability of SW1990 cells.

Pancreatic neoplasms; Galectin-3; Cell proliferation; Neoplasm invasiveness

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.009

江苏省创新团队医学领军人才项目(LJ201135)

226001 南通，南通大学附属医院消化科

周国雄，Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

2012-08-23)

(本文编辑：吕芳萍)