E-选择素在大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤组织的动态表达及其意义

盛闽 王锋 黄鹤光 陈志耀

·论著·

E-选择素在大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤组织的动态表达及其意义

盛闽 王锋 黄鹤光 陈志耀

目的探讨E-选择素在实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺组织的表达及其意义。方法按随机数字法将大鼠分为对照组及ANP组。采用逆行胆胰管注射5%牛磺胆酸钠制作大鼠ANP模型，术后3、6、12、24 h分批处死动物。检测血清淀粉酶、白蛋白及Ca2+水平，计算肺湿/干重比，常规行胰腺和肺组织病理检查并评分，实时荧光定量PCR及免疫组化法检测大鼠肺组织E-选择素mRNA和蛋白表达。结果ANP 6 h组大鼠血淀粉酶、胰腺及肺病理评分、肺湿/干重比分别为(3978±476)U/L、(8.22±0.63)分、(12.31±1.58)分、5.21±0.20，均显著高于对照组的(843±90)U/L、(0.22±0.36)分、(0.13±0.34)分、4.46±0.17(P<0.05或<0.01)；血清白蛋白水平为(12.9±1.0)g/L，显著低于对照组的(15.6±0.7)g/L(P<0.01)；12 h时的血Ca2+水平为(2.33±0.15)mmoL/L，显著低于对照组的(2.57±0.23)mmoL/L(P<0.01)。E-选择素定位于血管内皮细胞胞膜及胞质。ANP 6 h组大鼠肺组织E-选择素mRNA与蛋白表达显著高于对照组(3.51±0.45比0.95±0.16；0.174±0.019比0.060±0.006，P值均<0.01)。结论ANP大鼠并发肺损伤时肺组织的血管内皮细胞E-选择素表达呈时间依赖性上调，并参与白细胞的附壁及外渗，促进肺损伤。

胰腺炎，急性坏死性； 肺损伤； E-选择素； 模型，动物

重症急性胰腺炎(SAP)早期易诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，导致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，进而发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。E-选择素是内皮细胞特有的选择素，是诱导性黏附分子[1]，几乎仅表达在活化的内皮细胞上，在肺脏尤为明显。正常情况下内皮细胞仅少量表达E-选择素，在TNF-α、IL-1β及脂多糖等刺激后表达显著增加。本研究检测急性坏死性胰腺炎(ANP)并发ALI大鼠E-选择素的表达，评估E-选择素在ANP肺损伤中的作用。

材料与方法

一、实验动物及分组

清洁级雄性SD大鼠64只，体重200～250 g，由上海斯莱克动物中心提供，动物质量许可证号SCXK(沪)2007-0005。实验过程中对动物处置符合2006年科技部关于善待实验动物的规定[2]。

按照随机数字法将SD大鼠分为对照组和ANP组，每组32只。采用胆胰管逆行注射5%脱氧牛磺胆酸钠溶液1 ml/kg体重的方法制备ANP模型，对照组仅将胰腺翻动按摩后即关腹。术后3、6、12、24 h分批处死大鼠。心尖采血，离心分离血清。用预冷PBS由心尖入路快速灌注冲洗，去除肺组织血管床中残留血液，切取右下肺置-80°C冰箱保存，取右上肺及部分胰腺，甲醛固定，取左肺测湿、干重。

二、方法

1．血清淀粉酶、白蛋白及Ca2+水平检测：采用全自动生化分析仪(LX20，Beckman)测定。

2．肺湿/干重比(W/D)：吸干左肺表面水分，称湿重，然后将标本置于70℃烤箱烤72 h至恒重，称干重，计算W/D。

3．胰腺及肺组织病理学检查：常规行病理学检查，并参照Schmidt等[3]标准和Thome等[4]标准分别对胰腺及肺损伤评分。

4．E-选择素检测：采用免疫组化法检测E-选择素的表达，试剂盒购自武汉博士德公司，按说明书操作。兔抗大鼠E-选择素多抗(美国abCAM)工作浓度1∶100，生物素化羊抗兔IgG工作浓度1∶1000。以PBS代替一抗作为阴性对照。内皮细胞胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。在400倍光镜下随机选取5个视野，用image-Pro Plus6.0图像分析系统行图像扫描，以平均光密度值表示蛋白表达强度。

5．肺组织E-选择素mRNA 检测：按50～100 mg组织加入1 ml Trizol提取RNA。采用荧光定量PCR法检测E-选择素mRNA 表达。E-选择素引物上游5′-CTGCGATGCTGCCTACTTG-3′，下游5′-CCTGATTGCTCGCATCTTAGA-3′，产物231 bp；内参GAPDH引物上游5′-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游5′-CCAGTAGACTCCACGACATACTCA-3′，产物137 bp。逆转录反应：30℃ 10 min，42℃ 60 min，75℃ 15 min；PCR反应： 95℃ 2 min，95℃ 10 s、60℃ 40 s，45次循环。通过PCR仪自带软件获取△Ct值。mRNA表达量以2-△△Ct计算。以对照组为1，计算ANP组的表达倍数。

三、统计学处理

结 果

一、大鼠一般情况及胰腺、肺大体病理改变

ANP组大鼠术后逐渐出现气促加剧、烦躁不安或静默不动、厌食、呼吸困难等表现，濒临死亡前体温下降，口鼻有淡红色异常分泌物。处死后见腹腔内有浑浊血性腹水，胰腺充血水肿、出现黄色胶冻样凝固坏死和皂化斑形成；大网膜、肠系膜等处广泛粘连，肠管淤肿、扩张；肝脏表面见散在出血灶及黄白色坏死灶；肺脏表面有不同程度充血水肿，呈点状至片状出血斑，伴发3.5～5.5 ml胸水，24 h呈弥漫性出血(图1)。对照组大鼠无明显异常。

二、胰腺、肺组织病理改变

对照组大鼠胰腺组织结构基本完整清晰，腺泡细胞排列有序。ANP组大鼠胰腺水肿出血、炎症细胞浸润，腺细胞坏死，腺体结构消失，腺叶间隙增宽(图1)。对照组大鼠肺组织未见明显病理变化，ANP组大鼠3 h时见肺内毛细血管充血，间质水肿，少量炎症细胞浸润及红细胞渗出；6 h时病变加重，肺泡腔内见少量淡红色渗液，白细胞附着内皮细胞表面，内皮细胞部分水肿；12 h时肺泡腔内渗液、出血扩大，肺泡间隔明显增宽，炎症细胞浸润明显增多，部分肺泡萎陷不张，部分肺泡代偿扩张；24 h时肺组织内弥漫出血，肺泡结构紊乱，肺泡壁破裂，大量炎症细胞浸润，部分肺组织出现实变(图2)。胰腺及肺组织病理评分见表1。

图1ANP组24 h肺大体改变(a)和胰腺组织病理改变(b HE ×200)

图2对照组(a)及ANP组6(b)、24 h(c)组肺组织病理改变(HE ×200)

三、血清淀粉酶、白蛋白、Ca2+水平及肺W/D变化

ANP组血清淀粉酶呈阶梯状上升，于12 h达峰值，明显高于对照组水平(P<0.01)；血清白蛋白在6 h后较对照组明显下降(P<0.01)；Ca2+水平在12 h后明显下降(P<0.05)；肺W/D比在6 h后显著升高(P<0.01，表1)。

四、肺组织E-选择素 mRNA及蛋白表达的变化

对照组大鼠肺组织E-选择素 mRNA少量表达，ANP组E-选择素mRNA表达在3 h即明显升高，6 h达峰值，以后逐渐下降，但均高于对照组(P值均<0.01)。对照组肺组织血管内皮细胞仅见少量E-选择素蛋白阳性细胞，ANP组大鼠肺组织血管内皮细胞强阳性表达E-选择素，以6、12 h表达最强，显著高于对照组水平(P值均<0.01，表1，图3)。

图3对照组(a)及ANP6(b)、24 h(c)组E-选择素表达(免疫组化 ×400)

讨 论

E-选择素表达于炎症部位的内皮细胞，它的胞膜外区由1个C型凝集素样结构域、1个表皮生长因子样(EGF)结构域和6个补体调节蛋白样结构域(CCP)组成，通过其C型凝集素结构域同白细胞糖脂和糖蛋白上的唾液酸化路易糖(sLe)、唾液酸化的Lewis以及相关的岩藻糖基化的N-乙酰乳糖胺结合。E-选择素主要介导白细胞在内皮细胞表面最初的附壁和滚动，以及随后迁移到炎症组织。外渗到损伤组织中的白细胞被激活后释放炎症因子、氧自由基及破坏性的酶类物质等，损伤肺组织结构，导致ALI发生、发展[5-6]。一些有害的炎症因子也可以通过E-选择素介导进入到损伤组织中[7]，扩大损伤效应。Joucher等[8]报道，在离体小鼠肺细胞凋亡模型中，E-选择素的高表达是细胞凋亡的重要条件，且与FasL有关，还与蛋白酪氨酸磷酸酶活性增高有关。Hidalgo等[9]报道，E-选择素可使极化、激活的整合素αMβ2聚集在滚动的中性粒细胞前沿，进而捕获血小板和红细胞，导致急性血管闭塞，连同产生的氧化物引起血管损伤和肺组织急性损伤。

表1 各组大鼠检测指标比较

注：与对照组同时点比较，aP<0.05，bP<0.01

本研究结果显示，ANP大鼠肺组织E-选择素mRNA及蛋白表达均显著上调，肺组织小血管内皮早期出现白细胞的边集、渗出，以及在肺泡或肺间质中聚集，进一步证实E-选择素是白细胞与内皮细胞形成接触的启动因子，是诱导和扩大炎症损伤的重要“角色”。因此，抑制E-选择素表达对控制ANP及相关肺损伤发展具有重要作用。

[1] Ito S，Osaka M，Higuchi Y，et al．Enhanced adhesion of early endothelial progenitor cells to radiation-induced senescence-like vascular endothelial cells in vitro．J Radiat Res (Tokyo)，2009，50：469-475．

[2] 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导性意见．2006-09-30．

[3] Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al．A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy．Ann Surg，1992，215：44-56．

[4] Thome UH, Schulze A, Schnabel R，et al．Partial liquid ventilation in severely surfactant-depleted, spontaneously breathing rabbits supported by proportional assist ventilation．Crit Care Med，2001，29：1175-1180．

[5] Chooklin S．Pathogenic aspects of pulmonary complications in acute pancreatitis patients．Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009，8：186-192．

[6] 赵晓晏，周钢，郭萍．内皮素受体拮抗剂BQ123对大鼠急性坏死性胰腺炎E-、P-选择素表达的影响．胰腺病学，2006，6：157-160．

[7] Kleinhans H，Kaifi JT，Mann O．The role of vascular adhesion molecules PECAM-1 (CD 31), VCAM-1 (CD 106), E-selectin (CD62E) and P-selectin (CD62P) in severe porcine pancreatitis．Histol Histopathol，2009，24：551-557．

[8] Joucher F，Mazmanian GM，Michele GF．Role of E-selectin in cell apoptosis induced by allogeneic blood perfusion in isolated mouse lung．Transplantation，2005，80：666-672．

[9] Hidalgo A，Chang J，Jang JE，et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury．Nat Med，2009，15：384-391．

DynamicexpressionandsignificanceofE-selectininratofacutenecrotizingpancreatitisinducedlunginjury

SHENGMin,WANGFeng,HUANGHe-guang,CHENZhi-yao.

DerpatmentofSurgery,UnionHospital,FujianmedicalUniversity,Fuzhou350000,China

HUANGHe-guang,Email：hhuang2@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression and significance of E-selectin in lung tissue of rat of acute necrotizing pancreatitis (ANP)-induced lung injury.MethodsRats were randomly divided into control and ANP groups. ANP model was induced by retrograde injection of sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 3, 6, 12 and 24 h. Serum amylase, albumin, Ca2+and lung wet/dry (W/D) weight ratio were determined, and pancreas and lung tissues underwent routine pathological examination and histopathological scores were evaluated. The expression of E-selectin mRNA and protein in lung tissue of rat was measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsIn ANP group at 6h, the serum level of amylase, histopathological scores of pancreas and lung tissues, lung W/D weight ratio were (3978±476)U/L, 8.22±0.63,(12.31±1.58, 5.21±0.20, which were significantly higher than those in control group [(843±90)U/L, 0.22±0.36,0.13±0.34,4.46±0.17，P<0.05 or <0.01], the serum level of albumin was (12.9±1.0)g/L, which was significantly lower than that in control group [(15.6±0.7)g/L,P<0.01], the serum level of Ca2+at 12 h was (2.33±0.15)mmoL/L, which was significantly lower than that in control group [(2.57±0.23)mmoL/L,P<0.01]. E-selectin was located in the cell membrane and cytoplasm of vascular endothelial cells. Expression of E-selectin mRNA and protein in the lung tissue at 6h was significantly higher than those in control group (3.51±0.45vs0.95±0.16, 0.174±0.019vs0.060±.006,P<0.01).ConclusionsPulmonary expression of E-selectin of vascular endothelial cell is significantly up-regulated in a time dependant manner when ANP-induced ALI occurs; and it is involved in leukocyte mural and extravasation, and can promote lung injury.

Pancreatitis,acute necrotizing； Lung injury； E-selectin； Models,animal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.012

国家自然科学基金(81070369)

350000 福建福州，福建医科大学附属协和医院基本外科

黄鹤光，Email：hhuang2@yahoo.com.cn

2011-11-30)

(本文编辑：屠振兴)