葛根素对心肌纤维化模型小鼠左心室中Ⅰ型胶原表达的影响

唐 婕,陈 蓉,谢梅林

(1.苏州大学附属第一医院药学部,江苏苏州,215006;2.苏州大学药学院药理系,江苏苏州,215123)

多种心血管疾病如心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、心房颤动、高血压心脏损害、糖尿病性心肌病变、心肌病及心肌炎等,都伴有心肌重构的病理过程,而心肌纤维化(MF)是心肌重构的重要环节,切实有效的防治MF受到高度关注[1]。葛根素(Pue)为异黄酮类药物,系豆科植物野葛干燥根中的提取物,临床用于治疗多种心血管疾病。本研究探讨葛根素对异丙肾上腺(ISO)诱导的MF模型小鼠左心室Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)表达的影响,对阐述葛根素和MF的关系有一定理论意义和潜在的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器、药品与动物

倒置显微镜XDS-1B型(重庆光学仪器厂);722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);DS-671电子秤(上海寺冈电子有限公司);80-2型台式低速离心机(上海医疗器械集团有限公司);PK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏仪器设备有限公司);MR23i高速冷冻离心机(法国Jouan公司);MyCycler TM型PCR仪(美国Biorad公司)。葛根素(苏州长征制药厂馈赠,纯度≥99%,批号:080301);卡托普利(中美上海施贵宝制药有限公司,批号:0810031);异丙肾上腺素(ISO)(上海禾丰制药有限公司,批号:080701);羟脯氨酸(Hydro)试剂盒(南京建成生物公司,批号:20081202)。其余试剂为分析纯。CollagenⅠ引物购自上海生工科技公司。清洁级昆明种雄性小鼠(苏州大学实验动物中心),体质量22～25 g。

1.2 方法

1.2.1 给药方法及造模:葛根素低剂量(600 mg/kg)组、葛根素高剂量(1200 mg/kg)组及阳性药对照(卡托普利,25 mg/kg)组预先在上午灌胃给药3d后,同时在下午皮下注射ISO 5 mg/kg 1 d,后以2.5 mg/kg维持至30 d。停止注射ISO后,再继续给药1周。MF模型组以ISO5 mg/kg皮下注射1 d后,以2.5 mg/kg维持至30 d;溶媒对照组上午以0.5%的CMC-Na灌胃(葛根素用0.5%的CMC-Na溶液配制),3 d后在下午同时皮下注射生理盐水至30 d。停止注射生理盐水后,再继续以0.5%的CMC-Na灌胃1周。

1.2.2 心重指数(CWI)测定:末次给药后次日,5组小鼠称重,颈椎脱臼处死小鼠,取小鼠心脏,称重,计算CWI。

1.2.3 Hydro含量测定:采用消化法检测小鼠心肌组织Hydro含量,组织中的胶原经酶消化产生Hydro,Hydro在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色,在550 nm测定Hydro含量,具体操作按照Hydro测定试剂盒。考马斯亮蓝法测定总蛋白含量,具体操作按照总蛋白测定试剂盒。

1.2.4 CollagenⅠ mRNA测定:左心室匀浆后,用TRIzol提取总RNA,进行反转录和PCR。CollagenⅠ的引物:上游 5′-ACGTCCTGGTGAAGTT GGTC-3′,下 5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′,扩增片段长度为169 bp,退火温度为55℃。GAPDH 的引物:上游5′-GTATGACGTGGAGTC TACTG-3′, 下游 5′-TACTCCTTGGAGGCCATG TA-3′,扩增片段长度为728bp,退火温度为56℃。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,结果经凝胶扫描图像处理系统分析,以CollagenⅠ基因扩增带灰度与同管扩增的GAPDH基因扩增带灰度之比表示CollagenⅠmRNA表达水平。

2 结 果

2.1 对CWI和心肌Hydro含量的影响

CWI按照“CWI(mg/g)=全心质量/体质量”计算。Hydro含量按照试剂盒说明书的公式计算。结果显示,与溶媒对照组相比,模型组CWI和Hydro含量明显增加(P<0.01);与模型组相比,葛根素给药组均可降低CWI和Hydro含量,其中CWI降低了7.12%～10.15%,Hydro含量降低了18.28%～19.53%(P<0.05或P<0.01)。阳性药卡托普利组与模型组比较,CWI和Hydro含量也明显降低(P<0.01),见表1。

表1 葛根素对ISO诱导MF小鼠CWI、Hydro含量和CollagenⅠmRNA表达的影响(,n=8)

表1 葛根素对ISO诱导MF小鼠CWI、Hydro含量和CollagenⅠmRNA表达的影响(,n=8)

与溶媒对照组比较,＊P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。

组别 剂量(mg·kg-1) CWI(mg·g-1) Hydro(mg·g-1protein) CollagenⅠmRNA溶媒对照组3.75±0.17 4.58±0.51 0.21±0.03模型组 4.63±0.36＊ 5.58±0.63＊ 1.45±0.23＊葛根素低剂量组 600 4.30±0.21# 4.56±0.30## 0.98±0.21##葛根素高剂量组 1200 4.16±0.10## 4.49±0.86## 0.46±0.08##卡托普利组 25 4.20±0.37# 4.45±0.85## 0.65±0.07##

2.2 对左心室CollagenⅠmRNA表达的影响

模型组CollagenⅠmRNA表达明显增加,与正常对照组比较差异显著(P<0.01);葛根素给药组与模型组比较,CollagenⅠmRNA表达明显降低(P<0.01)。阳性药卡托普利组与模型组比较,CollagenⅠmRNA表达也明显降低(P<0.01),见表1。

3 讨 论

MF涉及的病因较多,不同病因所致胶原和心肌重构的具体机制不尽相同。从总体上讲,心肌胶原的异常蓄积是胶原生成大于胶原降解的结果,胶原生成与降解之间的动态平衡,涉及一系列的调控因素,而且这些因素之间存在着错综复杂的相互依存与相互制约关系。一旦这种平衡被破坏,胶原产生增多或降解减少,均可使胶原过多沉积,其中主要以CollagenⅠ为主,导致心室顺应性下降,影响心脏的正常收缩与舒张功能[2]。

本实验采用ISO诱导小鼠MF,表现为CWI,心肌Hydro含量明显增加,结果证明在小鼠身上成功的复制了ISO致MF的模型,改造模方法接近疾病进程,且相对无创、动物死亡率低,与其他文献的报道相一致[3-4]。本实验采用葛根素预防给药,可见MF小鼠的CWI、心肌 Hydro含量明显降低,说明葛根素能减轻MF的发展。RTPCR方法显示,用葛根素预防给药的MF小鼠左心室中CollagenⅠmRNA水平明显降低,由此推测,葛根素预防ISO诱导的小鼠MF的作用可能与抑制CollagenⅠ的表达有关,具体的作用机制还有待进一步研究。

[1]Cohn J N,Ferrari R,Sharpe N.Cardiac remodeling-concepts and clinical implications:a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.Behalf of an International Forum on Cardiac Remo deling[J].J Am Coll Cardiol,2000,35(3):569.

[2]徐冬玲,刘伟华,杜贻盟,等.PPARγ在糖尿病心肌纤维化大鼠心肌细胞及微血管内皮中的表达[J].山东大学学报,2008,46(9):847.

[3]李明,张军,陈燕,等.丹参抑制异丙肾上腺素引起的小鼠心肌肥厚和纤维化及其作用机制[J].中国药科大学学报,2003,34(6):565.

[4]邓玮,陈庆伟,李兴升,等.小鼠心肌纤维化模型的制备及其胶原沉积的机制[J].中国实验动物学报,2011,19(2):103.