受磷蛋白磷酸化位点Ser16在大鼠心力衰竭中的作用及机制

陈开祥,周新华,秦爱建

(1.江苏省连云港市第二人民医院急诊中心,江苏连云港,222000;2.扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室,江苏扬州,225003)

心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段,研究心力衰竭的发生机制对该病的防治极其重要。心肌舒缩功能与肌浆网钙泵(SERCA2a)的活性密切相关,SERCA2a活性主要由受磷蛋白(PLB)调控,PLB是心脏心肌收缩和β-肾上腺素能激活的基本调节蛋白[1]。本实验通过建立异丙肾上腺素诱导心力衰竭大鼠模型,观察心力衰竭大鼠肌浆网PLB基因和蛋白表达与磷酸化的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取6周龄S-D大鼠80只,雌雄不拘,体质量140～160 g,购置扬州大学医学院实验动物比较中心。

1.2 主要实验试剂与器材

H-89(美国CALBIOCHEM 公司);异丙肾上腺素(美国Sigma公司);[γ-32P]ATP(北京福瑞生物工程公司);Phospholamban小鼠抗大鼠单克隆抗体(美国ABR公司);HRP标记的山羊抗小鼠抗体(美国Sigma公司);HRP标记的抗大鼠GAPDH抗体(上海康成生物技术有限公司);ECL检测试剂盒(美国Pierce公司);Medlab生物信号采集系统(南京美易生物技术有限公司)。

1.3 心衰模型的制备[2]

造模组40只大鼠给予异丙肾上腺素2 mg/(kg·d)皮下注射,共4周,实验过程中死亡4只,存活36只。对照组(40只)给予0.9%生理盐水0.5 mL皮下注射。制模期间严格掌握给药量和给药时间,注意观察动物活动、全身状态和摄食情况。

1.4 实验动物分组和给药

造模4周后用导管法检测大鼠血流动力学。予直径约0.5 mm的硬塑管至左心室,连接八导电生理记录仪观察记录心率、左心室压力曲线,包括左心室舒张末压(LVEDP)和左心室收缩压(LVSP),推算左心室压力最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室压力最大下降速率(-dp/dtmax)。将造模成功的36只心衰大鼠和40只正常大鼠分别随机分H-89阴性亚组和阳性亚组。各组大鼠在相同条件下饲养,分组后大鼠分别进行如下处理:①H-89阳性亚组:按0.05 mg/(kg·d)予 H-89(3 μ mol/L)灌胃[3],1 d/次;②H-89阴性亚组:予等体积的二甲亚砜(DMSO)灌胃,1 d/次,共给药8周。

1.5 血流动力学测定和左心室重量指数(LVMI)测定

给药8周后如上方法再检测 LVSP及LVEDP,估算+dp/dtmax和-dp/dtmax。大鼠麻醉后称重,断头猝死立即取出心脏,剪取左心室和室间隔组织,滤纸吸干水分,称重,计算左室(含室间隔)与体质量比值,以mg/g表示。

1.6 PLBmRNA表达的检测

PLB:Forward:5′-AAGTCCAATACCT TAC TCGCTCGG-3′;Reverse:5′-TCACAGTAGCATCACAATGATGCAG-3′;β-actin:Forward:5′-AGCCATGTACGTAGCCATCCAG-3′;Reverse:5′-CGGTCAGGATCT TCATGAGGTAGT-3′,用Trizol法提取心肌组织总RNA。用AMV二步法进行反转录聚合酶链反应。反转录条件:42℃反转录1 h;PCR条件:95℃预变性5 min,94℃变性30s,72℃延伸30s,行28个循环扩增,再以72℃延伸8 min。电泳、凝胶成像,软件分析。并以PLB扩增带的平均灰度值分别与βaction扩增带的平均灰度值的比值表示PLB基因的表达量。

1.7 PLB蛋白表达的检测

先制备心肌肌浆网匀浆。将大鼠处死后取心室组织,充分研磨。将匀浆离心,收集上清再离心,上清再离心(20 kg,60 min,4℃),最后将获得的沉淀物(即肌浆网粗提物)用重悬液[成分(mmol/L):组氨酸 30、蔗糖 0.25、EDTA 10 和NaF 10,pH7.4]重悬。用Bradford法测定蛋白质浓度。

再各取20 μg变性总蛋白进行SDS-PAGE凝胶(15%)电泳,转膜,封闭抗原,与小鼠抗大鼠的单克隆PLB抗体(购自美国ABR公司,1:500稀释)杂交,洗膜并与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的抗体(购至美国SIGMA公司,1∶5000稀释)和HRP标记的抗大鼠的GAPDH抗体(购至上海康成生物技术有限公司,1∶5000稀释)共同孵育。显色,曝光、显影、定影,软件分析。并以PLB的平均灰度值与相应PAGDH的平均灰度值的比值表示PLB蛋白的表达量。

1.8 PLB磷酸化水平的检测

各取30 μg总蛋白置入 30 μL的反应液中,并迅速加入钒酸钠、焦磷酸钠、5.6 μL PKA 催化亚单位(H-89干预组同时再加入50 μ mol/L的H-8910 μL),37 ℃预孵育 5 min。加入 30 μ Ci[r-32P]ATP启动磷酸化反应,37℃5 min,加入SDS上样缓冲液终止磷酸化反应,再进行SDSPAGE凝胶(12%)电泳,染色、脱色、烘胶,曝光、显影、定影。软件分析计算条带的平均灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件分析处理,实验数据以均数±标准差()表示,采用卡方检验。P<0.05差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 对照组与造模组血流动力学参数和左室指数的检测和计算

与对照组比较,造模组的心肌收缩功能明显下降(P<0.05),左室指数显著增大(P<0.05)。结果见表1。

表1 对照组与造模组血流动力学参数和左室指数的比较()

表1 对照组与造模组血流动力学参数和左室指数的比较()

＊P<0.05。

分组 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVM I(mg/g)对照组 20 66.21±4.3 1.09±0.11 2608.4±40.8 -2620.8±35.8 0.353±0.03造模组 60 49.46±2.2＊ 2.83±0.36＊ 1806.6±38.4＊ -1789.3±39.0＊ 0.438±0.02＊

2.2 各实验组血流动力学参数和左室指数的检测和计算

前胡丙素组较心力衰竭组左室收缩功能明显改善(P<0.05),心脏左室指数明显降低(P<0.05);同时H-89亚组与相应的实验组比较,左室收缩功能增强(P<0.05),左室指数亦降低(P<0.05,唯有正常组2亚组 P>0.05)。如下表2。

表2 各实验组血流动力学参数和左室指数的比较()

表2 各实验组血流动力学参数和左室指数的比较()

与相应的对照组比较,△P<0.05,+H-89亚组与相应的组比较,＊P<0.05。

分组 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVM I(mg/g)对照组 10 69.31±4.9 1.17±0.14 2537.1±48.7 -2672.7±38.2 0.372±0.03+H-89亚组 10 57.52±4.7＊ 1.02±0.17＊ 2128.6±41.2＊ -2122.7±40.3＊ 0.387±0.04心衰组 12 49.65±2.2■ 3.03±0.38■ 1863.3±40.9■ -1895.2±37.4■ 0.440±0.05＊+H-89亚组 12 40.37±4.2＊ 2.21±0.31＊ 1724.1±34.5＊ 1735.0±35.7＊ 0.490±0.05＊

2.3 各组PLBmRNA表达量结果

与对照组比较,心力衰竭组PLBmRNA表达量明显升高(P<0.01),同时各H-89亚组较相应的实验组比较,PLBmRNA表达量均显著下降(P<0.01),见图1。

图1 各组PLBmRNA表达水平的比较

2.4 各组PLB蛋白表达量结果

与对照组比较,心力衰竭组蛋白表达量明显升高(P<0.01),同时各H-89亚组较相应的实验组比较,PLB蛋白表达量均显著下降(P<0.01),见图2。

图2 各组PLB蛋白表达水平的比较

2.5 各组PLB蛋白磷酸化水平检测结果

与对照组比较,心力衰竭组PLB蛋白磷酸化水平明显下降(P<0.01),同时各H-89亚组较相应的实验组比较,PLB蛋白磷酸化水平均显著下降(P<0.01),见图3。

图3 各组PLB磷酸化水平的比较

3 讨 论

心力衰竭是各种心脏病的终末期表现,众多研究已知心力衰竭与许多神经体液因子异常有关,但其具体发生的分子机制较复杂,目前并非十分明确,可能涉及各种离子通道、信号转导及能量产生等方面,其中心肌细胞内钙调节失衡尤为重要。肌浆网将Ca2+释放到细胞质而引起心肌细胞收缩;再通过SERCA2a将Ca2+泵回到肌浆网而实现心肌细胞舒张。迄今为止PLB被认为是肌浆网中调控SERCA2a的活性的唯一磷酸化底物。有研究显示SERCA2a活性减弱与心力衰竭的发生密切相关[4]。

作者在以往的实验中发现大鼠心肌细胞缺氧-复氧后PLB磷酸化水平显著下降,同时基因和蛋白表达水平亦明显下降[5]。本课题发现心力衰竭大鼠左室明显肥厚,而且收缩功能减弱,受磷蛋白基因表达和蛋白表达水平明显升高,可能与PLB在心力衰竭发展过程中长时间抑制SERCA2a的活性,心肌肌浆网调控Ca2+异常,致心肌收缩功能受损。同时心力衰竭大鼠PLB磷酸化水平下降,亦致使肌浆网SERCA2a转运钙离子能力下降,终出现心肌收缩功能不全。有学者[6]用基因转导或转基因技术证实未磷酸化的PLB能抑制SERCA2a的功能,减弱心肌收缩和舒张功能,在心力衰竭的发生发展中起到重要作用。在超表达PLB的转基因大鼠中,发现SERCA2a摄取Ca2+功能受抑制,心肌收缩功能受损,心室重塑、间质纤维化、胎儿基因转录和心肌肥厚,最终导致扩张型心肌病、心力衰竭[7]。在PLB缺陷小鼠中SERCA2a对Ca2+亲和力增强,心肌舒缩功能增强,而心率未发生变化,这进一步说明PLB在调节心脏功能方面起着重要作用[8]。本实验同上述亦证实了PLB在心力衰竭的发展过程中至关重要,可能通过调控肌浆网SERCA2a的活性终导致心肌舒缩功能障碍。

PLB的磷酸化则由不同的激酶和磷酸酯酶所调控。迄今为止已知PLB有3个磷酸化位点,分别为丝氨酸-16(Ser16),苏氨酸-17(Thr17)和苏氨酸-10(Thr10),其中Ser16可被cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)磷酸化。在β-肾上腺素能激动过程中,Ser16是主要磷酸化位点,并能调控完整的β-肾上腺素能效应;Thr17的磷酸化可能仅发生在胞质Ca2+浓度充分升高之后,即β-肾上腺素能激动达到最高水平时。cAMPPKA通路是心肌细胞发挥生理性能重要的神经激素信号传导通路。心肌β1-肾上腺素受体(β1-AR)激活,触发cAMP依赖的激酶活化,使心肌细胞PKA活性持久增强,促使PLB磷酸化,促进SERCA2a对 Ca2+的摄取,进而增加了肌浆网Ca2+浓度和促进肌肉收缩时Ca2+的释放终致心肌细胞收缩[9]。临床研究发现心力衰竭患者PLB Ser16和Thr17位点的磷酸化均下降,PLB的抑制作用明显增强[10]。本实验对各实验组大鼠分别给予PKA特异性抑制剂(H-89),观察各组PLB的表达水平和磷酸化水平以及心脏血流动力学改变。我们发现各H-89亚组较相应对照组PLBmRNA和蛋白表达水平明显下降,同时PLB磷酸化水平亦降低;而且各H-89亚组的心脏收缩功能较对照组均下降。我们推测H-89可能通过cAMP-PKA通路抑制心肌肌浆网PLB磷酸化,使SERCA2a对Ca2+的摄取能力下降,导致心肌收缩功能减退,造成心力衰竭。

[1]Zarain-Herzberg A,Regulation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in the hyperrophic and failing heart[J].Can J Physiol Pharmacol,2006,84(5):509.

[2]杜晓阳,谭武红,刘健,等.异丙基肾上腺素致豚鼠慢性心力衰竭模型的建立[J].西安交通大学学报(医学版),2006,27(5):464.

[3]Bouziane A M,Michel C,Catherine R M,et al.The Cytosolic Phospholipase A2 Pathway,a Safeguard of β2-Adrenergic Cardiac Effects in Rat[J].J Biol Chem.2005,280(19):18881.

[4]Tsuyoshi Tsuji,Federica del Monte,Yoshiro Yoshikawa,et al.Rescue of Ca2+overload-induced left ventriclur dysfunction by targeted ablation of phospholam-ban[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,296(2):H31.

[5]陈开祥,祝宝华,刘晨,等.缺氧预适应和前胡丙素预处理对心肌受磷蛋白磷酸化水平的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2008,10(3):210.

[6]Yamada M,Ikeda Y,Yano M,et al.Inhibition of protein phosphatase 1 by inhibitor-2 gene delivery ameliorates heart failure progression in genetic ardiomyopathy[J].FASEB J,2006,20(8):1197.

[7]Zhang T,Guo T,Mishra S,et al.Phospholamban Ablation Rescues Sarcoplasmic Reticulum Ca2+Handling but Exacerbates Cardiac Dysfunction in CaMKIIC Transgenic Mice[J].Circulation Research,2010,106(2):354.

[8]Sun Y L,Hu S J,Wang I H,et al.Effect of beta-blockers on cardiac function and calcium handling protein in postinfarction heart failure rats[J].Chest,2005,128(3):1812.

[9]Soto D,Arcangelis V D,Zhang J,et al.Dynamic Protein Kinase A Activities Induc-ed by β-Adrenoceptors Dictate Signaling Propagation for Substrate Phosphory-lation and Myocyte Contraction[J].Circulation Research,2009,104(6):770.

[10]Quaile M P,Rossman E I,Berretta R M,et al.Reduced sarcoplasmic reticulum Ca2+load mediates impaired contractile reserve in right ventricular pressure overload[J].J Mol Cell Cardiol,2007,43(5):552.