溶血磷脂酸对上皮细胞整合素β6表达的影响*

许铭炎， 邓小玲， 陈锡和， 杨利和， 姚小武， 傅玉才

(汕头大学医学院 1第二附属医院口腔科，2细胞生物与遗传学教研室，3细胞衰老实验室，广东 汕头 515041)

1000-4718(2012)03-0488-04

2011-10-22

2011-12-14

国家自然科学基金资助项目(No. 81072208)；广东省自然科学基金资助项目(No. S2011010005106)；广东省医学科研基金资助项目(No.A2010407)；汕头大学医学院基础与临床科研基金资助项目

△通讯作者 Tel: 0754-88900497; E-mail: caseydxl@yahoo.com

溶血磷脂酸对上皮细胞整合素β6表达的影响*

许铭炎1， 邓小玲2△， 陈锡和3， 杨利和1， 姚小武1， 傅玉才3

(汕头大学医学院1第二附属医院口腔科，2细胞生物与遗传学教研室，3细胞衰老实验室，广东 汕头 515041)

目的探讨溶血磷脂酸(LPA)在体外对整合素β6(ITGB6)表达的影响，并进一步研究LPA诱导的活化转化生长因子β(TGF-β)在此过程中的作用。方法原代培养的正常人支气管上皮(NHBE)细胞接种于6孔板中，经LPA诱导，收集细胞，分别利用RT-PCR和流式细胞术检测ITGB6 mRNA及细胞表面蛋白的表达；利用转染有TGF-β应答性纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)启动子片段并融合萤火虫荧光报告基因片段的转化貂肺上皮细胞(TMLC)作为TGF-β活性报告细胞检测活化的TGF-β。结果(1) 10 μmol/L LPA诱导2 h后，ITGB6 mRNA在上皮细胞中表达显著增加，具有明显的时间依赖性。(2) 10 μmol/L LPA诱导4 h后，上皮细胞表面ITGB6蛋白表达明显增加。(3) 抗αVβ6抗体可阻断LPA诱导的活化TGF-β，但不能阻断LPA诱导的ITGB6 mRNA的表达。结论(1) LPA可诱导上皮细胞ITGB6 mRNA和细胞表面蛋白的表达。(2) LPA诱导的ITGB6 mRNA 表达不依赖LPA 诱导的TGF-β活化。

溶血磷脂酸； 整合素β6； 上皮细胞； 转化生长因子β

整合素αVβ6是由αV亚单位和β6亚单位组成的跨膜异二聚体，是一种只特异性在上皮组织中表达的特殊亚型整合素[1]。它在正常上皮组织中几乎没表达，但在创伤愈合、炎症反应及肿瘤侵袭和转移时表达上调，参与上皮组织的重建修复及上皮组织源性恶性肿瘤的发生发展[2-6]，但影响其表达的具体因素并未完全阐明。虽然有报道转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)可上调整合素αVβ6的表达[7]，但上皮重建及肿瘤发生发展过程中需要多种生物活性物质参与，有必要进一步探讨影响αVβ6表达的其它因素。由于整合素β6亚单位(integrin β6, ITGB6)只能与αV亚单位形成，因此,ITGB6是αVβ6的关键性亚单位，可通过研究ITGB6的表达体现整个异二聚体αVβ6的表达状态。

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA) 是一种具有类生长因子活性的磷脂分子，存在于血浆、血清、唾液等多种体液中，促进细胞增殖、神经递质释放、细胞骨架改变以及肿瘤细胞移动和侵袭等[8]，参与上皮创伤修复及肿瘤发生发展等多种疾病的病理生理过程[9]。我们前期报道了LPA可诱导整合素αVβ6介导TGF-β的活化，参与组织纤维化进程[10]，但尚不清楚LPA是否可影响整合素αVβ6的表达，同时也不清楚整合素αVβ6的表达是否与LPA诱导的TGF-β活化存在相互作用。因此，本文以表达有整合素αVβ6的支气管上皮细胞NHBE为研究对象，探讨LPA对上皮细胞ITGB6表达的影响及其与TGF-β活化的关系，进而解析LPA对整合素αVβ6表达的影响。

材 料 和 方 法

1细胞株和试剂

正常人支气管上皮(normal human bronchial epithelial,NHBE)细胞株及培养基购自Lonza。转化貂肺上皮细胞(transformed mink lung epithelial cells,TMLC)由Dr.Rifkin 惠赠。LPA购自Sigma。抗整合素αVβ6单克隆抗体10D5和PE标记的羊抗鼠免疫球蛋白IgG均购自Chemicon。抗TGF-β的抗体1D11购自R&D。总RNA提取试剂盒购自北京东盛生物公司。cDNA合成及PCR反应试剂盒购自北京TransGen Biotech。

2方法

2.1细胞培养 NHBE细胞接种于50 mL培养瓶内，用KSF完全培养剂(含1.5 mg/L BSA、50 nmol/L EGF, 100 mg/L 青、链霉素)，于37 ℃、50% CO2培养箱中培养。3代以内的NHBE细胞接种于6孔培养板各孔内，用2 mL 完全培养液培养24 h后换无辅助培养剂的KSF培养液培养24 h。实验时，对照组内加入无辅助培养剂的KSF培养液，其它组每孔细胞内加入LPA(10 μmol/L)，分别培养0、15 min、1 h、2 h、4 h和6 h后收取细胞用于检测ITGB6 mRNA水平。

2.2逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测ITGB6 mRNA表达 应用通用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，1 μg总RNA经 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA， 取1μL cDNA利用ITGB6引物及GAPDH 引物进行PCR 反应( 2 × EasyTaq PCR SuperMix 试剂盒)，反应条件： 95 ℃预变性2 min，1个循环；接着95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30个循环；最终将PCR 产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统拍照记录实验结果，利用Photoshop软件对条带进行灰度分析。 ITGB6的上游引物5’-TCTGGAGTTGGCGAAAGG-3’，下游引物 5’-TCCACCGGGTAGTCCTCA-3’，产物片段245 bp。 GAPDH的上游引物5’- CAATGACCCCTTCATTGACCTC -3’，下游引物5’- CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3’，产物片段143 bp。

2.3流式细胞术检测细胞表面ITGB6蛋白的表达 用胰蛋白酶(trypsin)/EDTA收集单层培养的细胞，用羊血清在4 ℃下封闭20 min，1 000 r/min 离心沉淀细胞，用含有钙离子和镁离子的PBS漂洗1次，1 000 r/min 离心弃上清，在抗αVβ6的单克隆抗体10D5(10 g/L)中4 ℃下孵化20 min，接着用含有钙离子和镁离子的PBS漂洗2次，以标记藻红蛋白的Ⅱ抗羊抗鼠IgG(1∶200) 4 ℃染色20 min，然后再用PBS漂洗2次，取0.5 mL PBS重悬液在流式细胞仪中进行检测。

2.4TGF-β活性的检测 利用转染有TGF-β应答性纤溶酶原激活抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)启动子片段并融合萤火虫荧光报告基因片段的TMLC作为TGF-β活性报告细胞检测活化的TGF-β。TMLC在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中生长16 h后，用无血清的DMEM培养基饥饿培养2 h，利用胰酶消化收集细胞，用无血清的DMEM重悬为5×108cells/L，根据实验需要加入抗αVβ6抗体(5 g/L)或TGF-β抗体(10 g/L)，取100 μL/well TMLC悬液加入已接种NHBE细胞的96孔细胞培养板中进行共培养，同时加入100 μL不同浓度的LPA进入共培养体系，培养过夜后，吸弃上清，用PBS漂洗1次，加入报告基因系统细胞裂解液(Promega,北京)，充分振荡裂解，1 500×g4 ℃离心5 min，收集上清，加入荧光素酶分析缓冲液，用荧光发光检测仪进行检测。

3统计学处理

结 果

1LPA诱导上皮细胞ITGB6mRNA表达呈时间依赖性

RT-PCR结果显示，LPA作用2 h后即可诱导ITGB6 mRNA表达增加(P<0.05)，随着作用时间延长，ITGB6 mRNA的表达量显著增加，具有明显的时间依赖性，见图1。

图1LPA诱导上皮细胞ITGB6mRNA表达

2LPA诱导上皮细胞表面ITGB6蛋白表达

结果显示，NHBE 细胞表面可检测到ITGB6的表达峰，经LPA诱导4 h后，ITGB6表达峰明显右移，见图2，提示细胞表面的ITGB6表达增加。

3LPA上调ITGB6表达不依赖活化的TGF-β

结果显示,LPA可诱导支气管上皮细胞TGF-β的活化，且呈剂量依赖性，所诱导的活化TGF-β可被抗αVβ6抗体及抗TGF-β抗体阻断，见图3A；但RT-PCR结果显示抗αVβ6抗体不能阻断LPA诱导的ITGB6表达，提示LPA上调ITGB6的表达不依赖活化TGF-β的生成，见图3B。

讨 论

整合素αVβ6是一种重要的细胞黏附分子，探讨影响其表达的相关因素，有利于正确解释αVβ6在上皮炎症应答、重建修复及上皮源性恶性肿瘤中过度表达的分子机制，也为组织特异性下调整合素αVβ6表达提供新思路，并为寻找新的有效干预靶点奠定理论基础。

Figure 2. The expression of ITGB6 on epithelial cell surfaces was detected by flow cytometry.

图2上皮细胞表面ITGB6的表达

LPA作为一种重要的细胞外信号递质和细胞内第二信使。在正常生理状态下，具有促进细胞有丝分裂、影响细胞形态、加速伤口愈合等生理功能[11]；近年来研究发现LPA与肿瘤发生及侵袭转移等恶性化程度密切相关[12]；这些生物作用与整合素αVβ6有重叠。本研究通过RT-PCR及流式细胞检测技术发现，LPA可诱导上皮细胞ITGB6 mRNA和细胞表面蛋白表达，且呈时间依赖性，提示LPA的生物作用可能部分通过整合素αVβ6起作用，这可能是两者间生物功能重叠的原因之一。

我们的前期研究报道了LPA可诱导TGF-β的活化[10]，而TGF-β能上调ITGB6的表达，但我们通过抗体阻断实验，发现LPA诱导ITGB6表达不依赖于活化的TGF-β,也就是说，LPA对ITGB6表达的影响不需要通过活化的TGF-β，这提示LPA可能直接作用于ITGB6表达的调控元件，影响ITGB6的转录和翻译；另一方面提示LPA上调ITGB6表达的信号转导途径可能不同于LPA诱导TGF-β活化的信号转导途径，确切机制需要在以后的研究中进一步证实。

总之，本研究发现LPA是一种新的ITGB6表达诱导剂，这为ITGB6表达调控的研究提供另一诱导工具，也为αVβ6表达调控机制研究奠定了基础。同时，我们的结果提示LPA可能通过新的基因表达调控通路及信号转导分子影响整合素αVβ6的表达，这将进一步丰富基因调控及信号转导通路理论。

图3LPA上调ITGB6表达不依赖活化的TGF-β

[1] Breuss JM, Gillett N, Lu L, et al. Restricted distribution of integrin beta 6 mRNA in primate epithelial tissues[J]. J Histochem Cytochem， 1993, 41(10):1521-1527.

[2] Huang XZ, Wu JF, Cass D, et al. Inactivation of the integrin beta 6 subunit gene reveals a role of epithelial integrins in regulating inflammation in the lung and skin[J]. J Cell Biol，1996, 133(4):921-928.

[3] Huang X, Wu J, Spong S, et al. The integrin αvβ6 is critical for keratinocyte migration on both its known ligand, fibronectin, and on vitronectin[J]. J Cell Sci， 1998, 111(Pt 15):2189-2195.

[4] Niu J, Gu X, Ahmed N, et al. The αvβ6 integrin regulates its own expression with cell crowding: implications for tumour progression[J]. Int J Cancer， 2001, 92(1):40-48.

[5] 张 琦，胡燕燕，彭 程，等. αvβ6-ERK直接通路参与去甲斑蝥素诱导HT-29结肠癌细胞凋亡[J]. 中国病理生理杂志， 2011, 27(8):1525-1530.

[6] Thomas GJ, Nystrom ML, Marshall JF. αvβ6 integrin in wound healing and cancer of the oral cavity[J]. J Oral Pathol Med， 2006, 35(1):1-10.

[7] Sheppard D, Cohen DS, Wang A, et al. Transforming growth factor beta differentially regulates expression of integrin subunits in guinea pig airway epithelial cells[J]. J Biol Chem， 1992, 267(24):17409-17414.

[8] 周志斌，张志珺. 溶血磷脂酸与血管平滑肌细胞表型转化[J]. 中国病理生理杂志， 2009, 25(6):1228-1231.

[9] Lin ME, Herr DR, Chun J. Lysophosphatidic acid (LPA) receptors: signaling properties and disease relevance[J]. Prostaglandins Other Lipid Mediat， 2010, 91(3-4):130-138.

[10]Xu MY, Porte J, Knox AJ, et al. Lysophosphatidic acid induces αvβ6 integrin-mediated TGF-β activation via the LPA2 receptor and the small G protein Gαq[J]. Am J Pathol， 2009, 174(4):1264-1279.

[11]刘玉萍，王颖钰，钱文慧. 溶血磷脂酸(LPA) 对肿瘤转移的作用研究[J]. 中国药理学通报， 2011, 27(8):1044-1047.

[12]Mills GB, Moolenaar WH. The emerging role of lysophosphatidic acid in cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2003, 3(8):582-591.

Effectoflysophosphatidicacidonexpressionofintegrinβ6inepithelialcells

XU Ming-yan1, DENG Xiao-ling2, CHEN Xi-he3, YANG Li-he1, YAO Xiao-wu1, FU Yu-cai3

(1DepartmentofStomatology,TheSecondAffiliatedHospital,2DepartmentofCellBiologyandGenetics,3LaboratoryofCellSenescence,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:caseydxl@yahoo.com)

AIM: To investigate the effect of lysophosphatidic acid (LPA) on the expression of integrin β6(ITGB6) for determining the role of transforming growth factor β (TGF-β) activation induced by LPA in this process.METHODSNormal human bronchial epithelial (NHBE) cells were primarily cultured in 6 well plate and stimulated with LPA. The mRNA expression of ITGB6 and the level of cell surface ITGB6 protein were detected by RT-PCR and flow cytometry,respectively. The activity of active TGF-β induced by LPA was measured by the method of transformed mink lung epithelial cells (TMLC) transfected with TGF-β responsive plasminogen activator inhibitor 1(PAI-1) promoter fused with firefly luciferase reporter gene.RESULTSAfter stimulated with LPA at concentration of 10 μmol/L for 2 h, the mRNA expression of ITGB6 in epithelial cells was significantly increased in a time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that the protein level of ITGB6 on cell surface was obviously increased after treated with LPA at concentration of 10 μmol/L for 4 h. The active TGF-β induced by LPA in epithelial cells was blocked by an αVβ6blocking antibody. However, αVβ6blocking antibody failed to inhibit the mRNA expression of ITGB6 induced by LPA.CONCLUSIONLPA induces the mRNA and cell surface protein of ITGB6 in epithelial cells. The up-regulated ITGB6 expression by LPA is independent on LPA-induced TGF-β activation.

Lysophosphatidic acid; Integrin β6; Epithelial cells; Transforming growth factor beta

R735.35

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.018