应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白*

王顺清， 钟雯婷， 邓 晖， 毛 平， 许艳丽

(广州医学院附属市一人民医院 1血液科，2输血科， 广东 广州 510180)

1000-4718(2012)04-0730-04

2011-03-31

2012-03-08

国家自然科学基金资助项目(No.30871101)；广州市医药卫生科技重点资助项目(No.2006-ZDi-02)

△通讯作者 Tel：020-81048386；E-mail：drwangshq@medmail.com.cn

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白*

王顺清1△， 钟雯婷1， 邓 晖2， 毛 平1， 许艳丽1

(广州医学院附属市一人民医院1血液科，2输血科， 广东 广州 510180)

目的应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白，以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法应用GAL4酵母双杂交系统3，构建仅包含编码新基序535IVVY538的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY，并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母，筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白，通过回复性杂交实验验证其可靠性，并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白，包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8，其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白，其中RYBP可能性最大。

酵母双杂交； RANKL/RANK系统； IVVY基序； 相互作用蛋白质

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)占血液系统恶性肿瘤的10%～15%，其突出的临床特点之一就是进行性骨质破坏，称之为骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)，其治疗方法和疗效均有限，是影响MM患者生存质量和预后的重要因素之一。研究发现骨髓瘤患者核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)表达异常增高，致使RANKL与它的受体—核因子κB受体激活因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)组成的RANKL/RANK信号转导系统过度激活，促使大量巨噬细胞分化形成破骨细胞，这种破骨细胞生成过多且功能亢进在骨髓瘤骨病发生、发展中起关键作用，因此抑制RANKL/RANK 信号转导途径从而抑制破骨细胞的形成及其破骨功能是治疗骨髓瘤骨病最有效方法之一[1]。深入研究RANKL/RANK 信号转导途径及其转导蛋白，针对 RANKL/RANK 信号转导途径中各信号蛋白来研究、开发新的 MBD 治疗药物是研究的热点之一。我们前期的研究在RANK蛋白上鉴定出一个全新的基序——535IVVY538，它是破骨细胞形成所必需的位点，且介导了一条新的破骨细胞形成所必需的信号转导途径[2]。为进一步研究此信号转导途径，我们已成功构建出高质量的适合酵母双杂交实验的小鼠巨噬细胞cDNA 文库[3]，本研究旨在利用酵母双杂交技术筛选和找出与IVVY基序相互作用的RANK下游信号转导蛋白。

材 料 和 方 法

1材料

1.1载体与菌株 大肠杆菌DH5α购自Invitrogen，酵母AH109 菌株、pGBKT7 和pGADT7 质粒均购自Clontech。

1.2诱饵质粒和cDNA文库 本课题组已成功构建高质量小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库pGADT7 - library, 称AD/library。PCR扩增包含编码新基序535IVVY538的一小段小鼠RANK的cDNA片段(编码498～556号共59个氨基酸)，克隆到pGBKT7载体，构建出诱饵质粒pGBKT7-IVVY，称DNA-BD/bait。

1.3主要试剂 酵母双杂交系统(MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3，包含pGBKT7 和pGADT7 质粒等)、酵母质粒提取试剂盒(Easy Yeast Plasmid Isolation Kit)、酵母转化系统(YeastmakerTMYeast Transformation System 2)、酵母YPDA培养基、SD/-Trp 、SD/-Leu、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-半乳糖苷酶(X-α-galactosidase, X-α-Gal)、抗c-Myc和HA-Tag抗体等购自Clontech。大肠杆菌质粒提取试剂盒购自Qiagen。限制性内切酶和连接酶等购自NEB。其它试剂购自Sigma。

2方法

2.1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性检测 按照Clontech公司的说明书，利用标准PEG/LiAc方法分别转化诱饵质粒DNA-BD/bait和巨噬细胞cDNA文库质粒AD/library至酵母菌AH109，转化子再分别铺皿于SD /-Trp/X-α-Gal 和SD /-Leu/X-α-Gal培养基上，30 ℃培养3～4 d，通过观察酵母克隆是否生长、克隆大小及菌落颜色的变化，判断诱饵和文库质粒是否有自激活活性。同时用载体pCL1和pGBKT7-53质粒分别接种于SD /-Leu/X-α-Gal和SD /-Trp/X-α-Gal平板作为阳性和阴性对照组。

2.2AD/library及DNA-BD/bait在酵母中蛋白表达的检测 分别挑取一个转化了AD/library和DNA-BD/bait的酵母克隆接种于SD/-Leu和SD/-Trp液体培养基，于30 ℃振荡培养、扩增后低温低速离心收集，用Urea/SDS方法提取蛋白质。用抗c-Myc和HA-Tag单抗行Western blotting，检测AD/library及DNA-BD/bait质粒在酵母中的蛋白质表达情况；未转化的酵母AH109为阴性对照。

2.3AD/library及DNA-BD/bait共转化酵母进行筛库 利用Clontech公司YeastmakerTMYeast Transformation System 2试剂盒，按说明书将AD/library及DNA-BD/bait共转化AH109酵母感受态细胞，30 ℃培养90 min后，将菌液涂布于高选择强度的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上，30 ℃培养、观察7 d，筛选蓝色的阳性克隆。

2.4假阳性克隆的剔除及候选阳性质粒与诱饵质粒在酵母内相互作用的验证 挑取所有单菌落的阳性克隆，在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上反复、连续传代3次，3次均呈阳性的克隆再接种于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液体培养基，用酵母质粒提取试剂盒(Easy Yeast Plasmid Isolation Kit)提取酵母内质粒，转化至大肠杆菌DH5α中扩增，用Qiagen公司试剂盒抽提、纯化大肠杆菌质粒。然后，所获得的候选阳性质粒一对一与诱饵质粒DNA-BD/bait共转化酵母菌AH109，转化产物涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板, 不能生长或生长菌落呈白斑者作为假阳性剔除。这样也在酵母内进一步验证了所筛选出的阳性质粒与诱饵质粒的相互作用。

2.5阳性克隆的鉴定、分析 上述最后筛选出来的阳性质粒，一方面用限制性内切酶BsrGⅠ酶切、1%琼脂糖凝胶中电泳，根据片段大小进行分类；另一方面将阳性质粒进行测序, 在GenBank中进行同源性比对分析。

结 果

1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性检测

如图1所示，阳性对照组pCL1质粒的转化子在SD/-Leu/X-α-Gal平板见蓝色克隆生长，阴性对照pGBKT7-53质粒的转化子在SD/-Trp/X-α-Gal平板见白色克隆生长；AD/library及DNA-BD/bait质粒的转化子分别在SD/-Leu/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal平板上出现白色克隆生长；而且4种转化子的克隆生长良好，直径>2 mm，说明AD/library及DNA-BD/bait表达的蛋白无自激活活性。

Figure 1. Detection of autonomous activation of AD/library and DNA-BD/bait.Only positive control pCL1 showed blue colonies. Like negative control pGBKT7-53, AD/library and DNA-BD/bait showed white colonies.

图1AD/library及DNA-BD/bait自激活活性检测

2AD/library及DNA-BD/bait在酵母中蛋白表达的检测

从AD/library及DNA-BD/bait的克隆转化菌提取蛋白质，经Western blotting分析，分别检测到相应的HA和c-Myc标记的融合蛋白，见图2。

Figure 2. Detection of the expression of HA- and c-Myc- fusing protein in yeast.

图2酵母中HA和c-Myc融合蛋白表达的检测

3酵母的共转化筛库和候选阳性质粒的提取

我们共进行了3轮AD/library和DNA-BD/bait的酵母

AH109共转化，直接在高选择强度的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上进行筛库实验，总共筛选出25个阳性的蓝色克隆，将这25个克隆反复3次在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上接种传代得到18个阳性的蓝色克隆。提取这18个阳性酵母克隆中的质粒，并转化到大肠杆菌DH5α中扩增后提取和纯化出来，此过程中丢失4个阳性克隆的质粒，最后获得14个候选的阳性质粒，编号为1～14。

4候选阳性质粒与DNA-BD/bait相互作用的验证

将筛选出的14个候选阳性质粒一对一与DNA-BD/bait共转化AH109 酵母感受态，菌液铺于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选。有4个没有克隆形成，为假阳性克隆，最后获得10个阳性的候选质粒，见图3。

Figure 3. Verification of the interaction between candidate positive plasmids and DNA-BD/bait.No clone formed when 4 of all 14 candidate plasmids (No.6,12,13,14) and DNA-BD/bait were used to co-transform yeast strain AH109.They were false positive clones.

图3候选阳性质粒与DNA-BD/bait相互作用的验证

5候选质粒的分析和鉴定

候选质粒用BsrGⅠ酶切后电泳分析，其中6个质粒有相似的插入片段,另有2个质粒有相似大小的插入片段，其余2个各不相同。对这10个质粒的插入片段行DNA测序，在GenBank中进行同源性分析，结果与酶切分析一致，如表1所示，其中6个DNA序列完全一样，编码Ring1和YY1结合蛋白(Ring1 and YY1 binding protein，RYBP)；有2个DNA序列完全一样，编码ATP结合盒(ATP-binding cassette)；其余2个分别为编码E2F转录因子(E2F transcription factor)和热休克蛋白8 (heat-shock protein 8)的基因。而且，检查实验结果也发现，表达RYBP蛋白的阳性克隆出现最快。

表1 候选质粒的同源性分析

讨 论

酵母双杂交系统是Fields等[4]建立的一种检测蛋白-蛋白相互作用实验技术，其基本原理是：典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4等含有2个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)，二者可以从核酸一级结构上分开而独立表达出有功能的结构域，这2个结构域只要在同一细胞内能够彼此靠近，就可以激活下游报告基因的表达。因此将诱饵蛋白融合到一个结构域上(如BD-bait)，而将表达文库构建到另一个结构域上(如AD-library)，就可以筛选到与诱饵蛋白相互作用的蛋白。酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法。

RANKL/RANK系统涉及多种生理功能，信号转导复杂。本研究是要在鉴定出的RANK蛋白上介导破骨细胞形成所必需新基序535IVVY538的基础上，进一步研究此基序介导的新的信号转导途径，目的是要筛选直接与IVVY基序相互作用的下游信号转导蛋白，因此只选择了RANK基因上编码包括IVVY基序在内的一段cDNA片段(编码498～556号氨基酸)来构建诱饵质粒，这样诱饵蛋白只是包括IVVY在内的59个氨基酸，可以尽量减少RANK蛋白上其它的结构(如Motif 1～3等等)的干扰，使酵母双杂交所筛选到的候选蛋白更能针对于IVVY基序，有利于减少整个实验过程及结果分析的复杂性。

酵母双杂交实验中所用的cDNA文库是我们专门为此研究构建的[3]，来源于破骨细胞的前体细胞——巨噬细胞的mRNA，必然存在着丰富的介导巨噬细胞向破骨细胞转化的全套信号转导蛋白基因；文库平均滴度为3.24×109cfu/L，总容量达3.89×107cfu，平均插入片段为2.27 kb，重组率达95.83%，质量高，为酵母双杂交实验打下坚实的基础。

我们直接利用高选择强度SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal进行筛选，仅经过3轮的筛库，就得到10个阳性的候选质粒，经测序和同源比对分析，筛出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白。其中有6个是同一个基因，表达RYBP蛋白，它不仅出现的几率最高，而且实验中发现其阳性克”隆出现最快，提示它是可能性最大、相互作用最强的候选蛋白，下一步将首先展开重点研究，筛选到的其它候选蛋白也需进一步分析和验证。

RYBP是一个转录抑制因子，属PcG(polycomb Group)蛋白家族成员之一，可与PcG蛋白复合体的其它成分如Ring1、M33以及其它转录因子如YY1、E2F等相互作用，通过PcG蛋白依赖性的表观遗传学机制，如启动子区CpG岛甲基化、组蛋白修饰(H3甲基化、H2A泛素化)等，调节下游基因的转录活性，发挥多种生理或病理功能。RYBP基因敲除小鼠在胚胎期就死亡，RYBP表达缺陷会导致眼睛和中枢系统发育异常[5]。研究还证实RYBP参与细胞的增殖、分化以及凋亡等[6-7]，与生物体生长发育、肿瘤发生发展等密切相关。本研究发现了RYBP可能通过IVVY基序与RANK蛋白相互作用，介导破骨细胞生成，这为进一步研究RANKL/RANK信号系统介导破骨细胞形成的生理机制提供了一个切入点。但RYBP与RANK之间相互作用的具体途径、机制等，有待于进一步验证和研究。

(致谢：本研究在美国阿拉伯马大学伯明翰分校冯旭副教授的悉心指导和大力支持下完成，深表感谢！)

[1] Sezer O. Myeloma bone disease: recent advances in biology, diagnosis, and treatment [J]. Oncologist，2009，14(3):276-283.

[2] Xu D, Wang S, Liu W, et al. A novel receptor activator of NF-κB (RANK) cytoplasmic motif plays an essential role in osteoclastogenesis by committing macrophages to the osteoclast lineage [J]. J Biol Chem, 2006, 281(8):4678-4690.

[3] 王顺清，林蔡弟，毛 平,等. 小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定[J]. 中华生物医学工程杂志， 2010，16(4)：292-297.

[4] Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein- protein interactions [J]. Nature, 1989, 340(6230): 245-246.

[5] Pirity MK,Wang WL,Wolf LV, et al. Rybp, a polycomb complex-associated protein, is required for mouse eye development[J].BMC Dev Biol, 2007, 7:39.

[6] González I, Aparicio R,Busturia A. Functional characterization of thedRYBPgene in Drosophila[J]. Genetics, 2008,179(3):1373-1388.

[7] Novak RL, Phillips AC. Adenoviral-mediated Rybp expression promotes tumor cell-specific apoptosis[J]. Cancer Gene Ther,2008,15(11):713-722.

ScreeningofproteinsinteractingwithIVVYmotifofRANKproteinbyyeasttwo-hybridtechnique

WANG Shun-qing1, ZHONG Wen-ting1, DENG Hui2, MAO Ping1, XU Yan-li1

(1DepartmentofHematology,2DepartmentofBloodTransfusion,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China.E-mail:drwangshq@medmail.com.cn)

AIM: To explore the new downstream signal transduction proteins mediating osteoclast formation in RANKL/RANK system by the technique of yeast two-hybrid in mouse macrophages.METHODSUsing MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3, a small piece of RANK cDNA which harbored a cDNA fragment coding a novel motif,535IVVY5381， was sub-cloned into pGBKT7 to construct the bait plasmid (named as pGBKT7-IVVY). The yeast strain AH109 co-transformed with pGBKT7-IVVY and a yeast expression macrophage cDNA library (pGADT7-library) was used to screen the proteins interacting with IVVY motif of RANK. Repeated yeast two-hybridization experiments were conducted to exclude the false positive clones and to verify the interactants. The positive clones were sequenced and analyzed with BLAST in NCBI.RESULTSFour candidate proteins probably interacting with IVVY were obtained, including Ring1 and YY1 binding protein (RYBP), ATP-binding cassette, E2F transcription factor and heat-shock protein 8. The clone coding RYBP was screened out frequently and quickly.CONCLUSIONFour candidate interactive proteins are successfully identified using yeast two-hybrid screening. RYBP is the most probable one.

Yeast two-hybrid; RANKL/RANK system; IVVY motif; Interactive protein

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.027